淫羊藿类外泌体囊泡改善血管平滑肌细胞钙化:蛋白组学分析OA

背景:血管钙化属于骨代谢异常,病理机制与骨矿化过程高度相似,淫羊藿作为传统中药,在心血管疾病的应用以及如何改善生物利用度等问题尚无有效证据。目的:探讨淫羊藿类外泌体囊泡改善血管钙化的作用及分子机制。方法:(1)利用密度梯度离心法提取淫羊藿类外泌体囊泡,通过透射电镜、纳米粒径检测仪与纳米颗粒追踪分析仪进行鉴定;(2)CCK-8实验检测淫羊藿类外泌体囊泡对主动脉平滑肌细胞活性的影响;共聚焦扫描显微镜观察主动脉平滑肌细胞对淫羊藿类外泌体囊泡摄取情况;(3)通过蛋白组学技术对淫羊藿类外泌体囊泡蛋白成分进行分析鉴定,筛选出可能的功能蛋白;(4)将主动脉平滑肌细胞分为空白组、模型组以及淫羊藿类外泌体囊泡低、中、高剂量组,培养48 h后用共聚焦显微镜观察细胞骨架变化;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot检测Ras同源家族成员A/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶通路相关蛋白表达水平;ELISA检测Ras同源家族成员A-GTP水平;培养7 d后茜素红S染色检测细胞钙化面积,Western blot检测成骨相关蛋白表达水平。结果与结论:(1)淫羊藿类外泌体囊泡呈茶托状,粒径在50-200 nm之间;(2)CCK-8实验显示淫羊藿类外泌体囊泡对细胞活性没有明显的影响;囊泡能被主动脉平滑肌细胞有效摄入,具有生物活性;(3)蛋白组学分析淫羊藿类外泌体囊泡中可能含有37种特异性蛋白,基因本体分析提示淫羊藿类外泌体囊泡可能通过复杂的蛋白互作网络,协同参与细胞代谢、信号转导及应激反应等过程发挥抗血管钙化作用;(4)茜素红S染色显示淫羊藿类外泌体囊泡组钙化面积较模型组显著减少;流式细胞术检测显示淫羊藿类外泌体囊泡具有显著的抗凋亡保护作用;共聚焦显微镜结果显示,与模型组相比,淫羊藿类外泌体囊泡低、中、高剂量组细胞骨架结构逐渐改善,呈剂量依赖性保护趋势;Western blot检测结果显示,与模型组相比,淫羊藿类外泌体囊泡低、中、高剂量组Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2、磷酸化Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1表达水平呈剂量依赖性降低,α-平滑肌肌动蛋白、平滑肌22α表达水平呈剂量依赖性升高;ELISA检测结果显示Ras同源家族成员A-GTP呈剂量依赖性降低。研究结果表明淫羊藿类外泌体囊泡可有效改善血管钙化,可能通过调控Ras同源家族成员A/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶通路发挥抗钙化作用。