暴马桑黄细胞色素P450家族CYP6620B1基因克隆及真核表达分析OA

【目的】克隆暴马桑黄三萜类化合物合成下游途径中关键CYP6620B1基因的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析和真核表达分析,以期为阐明暴马桑黄三萜生物合成途径机制及提高三萜产量提供理论依据。【方法】采用qRT-PCR技术检测CYP6620B1基因在暴马桑黄菌丝体、原基、子实体等不同发育阶段的转录水平。采用PCR扩增技术获得目的基因的cDNA序列全长,采用生物信息学在线软件分析其蛋白的理化性质和空间结构。采用LiAC/PEG法获得重组酿酒酵母菌株INVSc/pYES2-CYP6620B1,并采用酶标仪法检测其总三萜含量。【结果】CYP6620B1基因在暴马桑黄不同发育阶段的转录水平呈现先上升再下降的趋势,与已报道的暴马桑黄中总三萜含量的变化趋势相吻合,提示其可能参与三萜合成调控,进而克隆获得了CYP6620B1基因cDNA全长,为1629 bp,编码542个氨基酸,不具有信号肽和跨膜结构,亚细胞定位于细胞质和内质网;系统进化分析结果表明,暴马桑黄CYP6620B1蛋白和牛樟芝蛋白同源性最高;分子对接结果显示,CYP6620B1蛋白与羊毛甾醇的结合能最低并具有良好的对接构象;CYP6620B1基因成功在酿酒酵母菌株INVSc中实现表达,且重组酿酒酵母菌株INVSc/pYES2-CYP6620B1中总三萜含量显著高于对照菌株。【结论】成功克隆得到可能参与暴马桑黄三萜合成途径的CYP6620B1基因,并对其进行分析,为深入探究该基因在暴马桑黄三萜生物合成途径中的功能奠定了基础。