轻型血友病A患者采用一期法与发色底物法检测凝血因子Ⅷ促凝活性结果差异分析及机制研究OA

目的:一期法检测(one-stage clotting assay,OSA)测定凝血因子Ⅷ活性(FⅧ:C)是目前临床最常用的方法,但在携带特定错义突变的血友病A患者中,OSA测得的FⅧ:C水平可能高于临床出血表型所提示的水平,导致疾病严重程度被低估,甚至造成血友病的漏诊,而发色底物法检测(chromogenic substrate assay,CSA)常用于OSA的补充。本研究分析轻型血友病A(mild hemophilia A,MHA)患者的基因型及实验室表型,并探讨OSA、CSA及凝血酶生成试验(thrombin generation test,TGT)在MHA诊断中的应用价值。方法:2019年6月至2025年9月,回顾性收集我院疑诊为MHA,且OSA的FⅧ:C水平与实际出血表型不符的男性患者5例,为连续入组,患者年龄范围为24~75岁。收集所有患者临床资料,采用OSA和CSA检测患者的FⅧ:C,并比较2种方法的检测结果间的差异;采用TGT评估患者的整体凝血潜力;采用二代测序结合桑格测序确定患者的F8基因型,并采用PyMOL软件对FⅧ结构域及关键氨基酸残基进行可视化分析,探讨突变对FⅧ空间结构的影响。结果:OSA提示,5例患者(A-E)中,3例(A、C、E)患者的FⅧ:C<40%,而2例(B、D)患者FⅧ:C分别为55.3%、63.7%。CSA结果提示,5例患者CSA的FⅧ:C水平在7.8%~25.7%之间,5例患者均诊断为MHA。OSA结果/CSA结果比值为1.3~5.5,CSA结果更符合患者的临床出血表型。5例患者中,4例进行了TGT,与正常人混合血浆相比,患者的凝血酶生成潜力、凝血酶峰值及凝血酶生成速率均降低,达峰时间延长。5例患者中,共检出4种已报道的F8错义突变,分别为p.V285M(患者A)、p.A303P(患者C)、p.S308L(患者B、D)、p.R546W(患者E)。PyMOL软件分析提示,前3个突变位于FⅧ的A1、A3与A2结构域相互作用界面,可能通过影响活化的FⅧ(FⅧa)的稳定性,造成OSA检测结果与临床出血表型不一致。p.R546W突变则位于该相互作用界面附近,对FⅧa稳定性的影响相对较小。结论:OSA测得的FⅧ:C水平可能与部分MHA患者的临床出血表型不一致,联合应用OSA和CSA有助于提高诊断准确率。TGT可用于辅助评估患者的整体凝血功能,为疾病精准诊断提供参考。