AFPⅢ对猪精液抗冻保存的作用OA

【目的】将抗冻蛋白Ⅲ(AFPⅢ)作为精液的抗冻稀释液添加剂,利用蛋白质测序技术从蛋白质水平上确定AFPⅢ对猪精液抗冻性的调控机制,为开发AFPⅢ作为抗冻添加剂进一步改善冷冻猪精液品质提供理论依据。【方法】在健康大白种公猪精液基础抗冻液中添加AFPⅢ进行冷冻精子质量检测。对经最佳浓度AFPⅢ处理的冻存精液样本,采用定量精子蛋白质组学技术筛选差异表达蛋白(DEP)。进一步通过GO功能注释和KEGG富集分析,系统注释DEP所涉及的生物学过程和信号通路,从中筛选出与精子抗冻调控相关的关键DEP,并利用Western blot方法进行验证。【结果】添加1.0μg·mL^(-1)AFPⅢ较未添加组显著提高了冻存精子的活率、活力、质膜完整性、顶体完整性、线粒体活性、直线运动速度、平均路径速度、摆动性和前向性(P<0.05);同时,显著降低了冻存精子的活性氧(ROS)含量和丙二醛(MDA)浓度(P<0.05),显著提高总抗氧化能力(T-AOC)(P<0.05)。1.0μg·mL^(-1)AFPⅢ添加组存在53个上调DEP和16个下调DEP;GO功能注释显示,DEP主要参与顶体反应和精子发生等生物反应过程;KEGG富集分析显示,DEP主要富集在烟酸及烟酰胺代谢、谷胱甘肽代谢和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号等通路中。筛选并通过Western blot检测,获得3个参与多项精子发生和能量代谢通路的DEP,分别为PPARβ、载脂蛋白A1(APOA1)和细胞色素C体细胞(CYCS),其参与AFPⅢ对猪精子抗冻保护作用。【结论】AFPⅢ作为抗冻添加剂的最佳添加质量浓度为1.0μg·mL^(-1),其发挥精子抗冻保护作用的关键蛋白包括PPARβ、APOA1、CYCS,这些蛋白参与烟酸及烟酰胺代谢、谷胱甘肽代谢和PPAR信号等通路。