补肾活骨汤含药血清对小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响及其作用机制OA

目的:探究补肾活骨汤含药血清对小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响及其作用机制。方法:(1)补肾活骨汤含药血清和空白血清制备方法。将24只SD大鼠随机分为补肾活骨汤含药血清制备组和空白血清制备组,每组12只,分别给予补肾活骨汤药液和蒸馏水灌胃,连续灌胃7 d后,采集腹主动脉血,制备补肾活骨汤含药血清和空白血清。(2)补肾活骨汤含药血清干预浓度的筛选方法。取第3代小鼠RAW264.7细胞,分为空白对照组及10%、15%、20%、25%补肾活骨汤含药血清组。空白对照组加入10%的空白血清,10%、15%、20%、25%补肾活骨汤含药血清组分别加入10%、15%、20%、25%的补肾活骨汤含药血清。培养24 h后,采用MTT法检测各组小鼠RAW264.7细胞的活力,确定干预浓度。(3)补肾活骨汤含药血清对小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化影响的分析方法。取第3代小鼠RAW264.7细胞,分为空白对照组、诱导分化组及10%、15%、20%补肾活骨汤含药血清组。除空白对照组外,其余各组均加入终浓度为100 ng·mL^(-1)的巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimula-ting factor,M-CSF)和50 ng·mL^(-1)的核因子κB受体激活蛋白配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL);同时,空白对照组和诱导分化组加入10%的空白血清,10%、15%、20%补肾活骨汤含药血清组分别加入10%、15%、20%的补肾活骨汤含药血清。培养5 d后,进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色,并统计各组小鼠RAW264.7细胞分化的破骨细胞数量。(4)补肾活骨汤含药血清影响小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化作用机制的分析方法。取第3代小鼠RAW264.7细胞,分为空白对照组、诱导分化组、20%补肾活骨汤含药血清组。除空白对照组外,其余各组均加入终浓度为100 ng·mL^(-1)的M-CSF和50 ng·mL^(-1)的RANKL;空白对照组和诱导分化组加入10%的空白血清,20%补肾活骨汤含药血清组加入20%的补肾活骨汤含药血清。培养5 d后,采用实时定量PCR检测TRAP和活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1)的mRNA表达水平,采用Western Blot法检测NFATc1、组织蛋白酶K、多囊蛋白1、PDZ结合基序转录共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)的蛋白表达水平。结果:(1)补肾活骨汤含药血清干预浓度的筛选结果。空白对照组及10%、15%、20%补肾活骨汤含药血清组小鼠RAW264.7细胞活力组间两两比较,差异均无统计学意义(P=0.745,P=0.922,P=0.981,P=0.958,P=0.999,P=0.993),25%补肾活骨汤含药血清组小鼠RAW264.7细胞活力低于空白对照组及10%、15%、20%补肾活骨汤含药血清组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000)。确定补肾活骨汤含药血清干预浓度为10%、15%、20%。(2)补肾活骨汤含药血清对小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化影响的分析结果。空白对照组无破骨细胞。10%补肾活骨汤含药血清组小鼠RAW264.7细胞分化的破骨细胞数量与诱导分化组的差异无统计学意义(P=0.209),15%、20%补肾活骨汤含药血清组小鼠RAW264.7细胞分化的破骨细胞数量均少于诱导分化组和10%补肾活骨汤含药血清组(P=0.000,P=0.001;P=0.016,P=0.002);20%补肾活骨汤含药血清组小鼠RAW264.7细胞分化的破骨细胞数量少于15%补肾活骨汤含药血清组(P=0.046)。(3)补肾活骨汤含药血清影响小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化作用机制的分析结果。诱导分化组、20%补肾活骨汤含药血清组小鼠RAW264.7细胞TRAP、NFATc1的mRNA相对表达量和NFATc1、组织蛋白酶K、多囊蛋白1、TAZ的蛋白相对表达量均高于空白对照组(P=0.000,P=0.000;P=0.002,P=0.011;P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000;P=0.001,P=0.002;P=0.000,P=0.001),20%补肾活骨汤含药血清组小鼠RAW264.7细胞TRAP、NFATc1的mRNA相对表达量和NFATc1、组织蛋白酶K、多囊蛋白1、TAZ的蛋白相对表达量均低于诱导分化组(P=0.000,P=0.000,P=0.008,P=0.005,P=0.006,P=0.022)。结论:补肾活骨汤含药血清能够抑制小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化,其作用机制可能通过下调多囊蛋白1、TAZ的表达进而抑制NFATc1、组织蛋白酶K等破骨细胞分化相关基因的表达。