人骨髓间充质干细胞衰老削弱其衍生凋亡囊泡的骨诱导特性OA

目的探讨亲代人骨髓间充质干细胞(BMSCs)的衰老状态对其衍生凋亡囊泡(apoVs)骨诱导特性的影响,为基于apoVs的牙槽骨缺损及骨质疏松治疗提供实验依据及质量控制参考。方法本研究通过连续传代构建衰老BMSCs(A-BMSCs)模型,以年轻BMSCs(Y-BMSCs)作为对照。在星形孢菌素诱导细胞凋亡后,分别从Y-BMSCs和A-BMSCs中提取apoVs(Y-BMSCs来源apoVs,Y-apoVs;A-BMSCs来源apoVs,A-apoVs)。首先对2种囊泡的表征(形态、粒径、电位、产量及蛋白标志物等)进行系统鉴定。随后,将Y-BMSCs分为增殖培养(PM)组、成骨诱导(OM)组、OM+Y-apoVs组和OM+A-apoVs组,通过碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色及实时定量PCR检测成骨相关基因runt相关转录因子2(RUNX2)、ALP、骨桥蛋白(OPN)及成骨特异性转录因子(OSX)的表达,评估其体外骨诱导效能。获得单位实验动物伦理委员会批准,利用18月龄的C57BL/6老龄小鼠模型验证使用红色荧光染料PKH26标记的2种apoVs的体内分布及骨诱导效能,将小鼠随机分为Control组(注射PBS)、Y-apoVs组(注射Y-apoVs)和A-apoVs组(注射A-apoVs),连续8周尾静脉注射apoVs,通过微计算机断层扫描和组织学分析评估其骨再生效果。结果电镜及粒径分析显示,Y-apoVs和A-apoVs均呈典型的双凹圆盘状结构,粒径主要分布在100~500 nm;Western blot证实两者均高表达囊泡通用标志物(CD9、CD63、CD81)及凋亡标志物Fas。Y-apoVs和A-apoVs的形态无差异,两者在粒径、电位、产量及蛋白标志物表达差异上均无统计学意义。体外实验显示,与PM组相比,OM组、OM+A-apoVs组、OM+Y-apoVs组均能显著增强靶细胞Y-BMSCs的ALP活性及钙结节沉积,并显著上调RUNX2、ALP、OPN、OSX的表达(P<0.05);且与OM组及OM+A-apoVs组相比,OM+Y-apoVs组的上述促进作用更为显著(P<0.05)。体内实验证实,尾静脉注射的apoVs可有效归巢至骨组织,且Y-apoVs组能更有效地改善老龄小鼠的骨微结构,显著提高骨矿物质密度及骨体积分数,其疗效优于Control组和A-apoVs组(P<0.05)。结论亲代细胞的衰老状态显著削弱了BMSCs来源apoVs的骨诱导能力。Y-apoVs是治疗年龄相关性骨丢失的有效生物制剂。