栀子类胡萝卜素异构酶基因GjD27的克隆及功能分析OA

【目的】对栀子(Gardenia jasminoides Ellis)的类胡萝卜素异构酶D27基因(GjD27)进行克隆和功能解析。【方法】通过边合成边测序(sequencing by synthesis,SBS)和单分子实时测序(single molecule real-time sequencing,SMRT)技术,获得栀子茎、叶、果实、种子和花萼的转录组数据,利用生物信息学软件进行基因注释,然后克隆GjD27基因。利用pET-32a(+)原核表达系统进行蛋白表达,将表达质粒与产β-胡萝卜素底物的质粒共转化至大肠杆菌,利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测催化产物。【结果】转录组分析显示:SBS和SMRT测序分别获得118.84和25.50 Gb的高质量数据,注释得到10535条特异基因。克隆得到GjD27基因,其cDNA全长1116 bp,编码169个氨基酸,在叶片中表达量最高。在16℃、200 r/min条件下,携带GjD27的pET-32a(+)质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中经0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导,可以高效表达可溶性蛋白。HPLC检测结果表明:与对照相比,GjD27蛋白显著提高了全反式-β-胡萝卜素的含量,并显著降低了9-顺式-β-胡萝卜素的含量,证明GjD27具有催化9-顺式-β-胡萝卜素转化为全反式-β-胡萝卜素的功能。【结论】本研究克隆了栀子类胡萝卜素异构酶基因GjD27,其功能解析为阐明和调控栀子独脚金内酯生物合成途径奠定了基础。