石斑鱼虹彩病毒qPCR和ERA-LFD检测方法的建立及应用OA

新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)是蛙病毒属的1种高致病性DNA病毒,可导致养殖石斑鱼和其他海水鱼类的大规模死亡,但目前尚无有效的治疗方法,主要以定期监测和早期预防为主,因此,建立准确高效的SGIV检测方法至关重要。本研究针对SGIV的支架蛋白ORF075R建立了SGIV qPCR绝对定量和酶促重组等温扩增结合测流层析试纸条技术(enzymatic recombinase amplification combined with lateral flow dipstick,ERA-LFD)可视化两种检测方法并应用于石斑鱼临床样本的定性和定量快速检测。结果表明:引物对075R241-F/R在10种常见石斑鱼组织上无非特异性扩增,构建含有目的片段的重组质粒作为病毒标准品,建立了其拷贝数(X)与相应的Ct值(Y)的标准曲线[Y=−3.34×lg(X)+33.16,R2=0.9998],组内和组间重复性实验均显示出良好的的重复性和稳定性。ERA-LFD快速检测方法最佳反应温度为37~40℃,最佳反应时间为20 min,具有快速可视化优点。灵敏度分析显示,ERA-LFD的最低检出限为1.2×10^(2) copies/反应(反应液浓度2.4 copies/μL),其绝对灵敏度与qPCR(6.0×10^(1)copies/反应,6.0 copies/μL)相当,远高于常规PCR反应。两种方法与神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)、刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)等石斑鱼常见病原无交叉反应,特异性良好。采用多方法对15尾棕点石斑鱼临床样本进行平行验证,结果完全一致。依据WOAH指南,以qPCR为参比方法对135份临床样本进行评估,ERA-LFD的诊断特异性(DSp)与灵敏度(DSe)分别达到100%和94.7%。进一步将该方法拓展应用于19份养殖环境水样进行验证,其阳性检出率为52.6%,表明该方法在环境样本检测中具有良好应用潜力。综上所述,本研究成功构建了兼具快速、灵敏、特异及稳定特性的SGIV qPCR绝对定量与ERA-LFD可视化快检方法,为SGIV的现场快速筛查与早期预警防控提供了可靠、实用的技术支撑。