10-羟基-2-癸烯酸介导自噬与抗氧化能力增强促成骨分化OA

背景:10-羟基-2-癸烯酸具有较强的抗炎、抗氧化和免疫调节作用,但它在骨代谢调控中的作用尚不明确。目的:探讨10-羟基-2-癸烯酸在骨重建过程中的调节作用及潜在机制。方法:①采用不同浓度(0,0.5,1,2,4 mmol/L)的10-羟基-2-癸烯酸培养大鼠骨髓间充质干细胞,细胞骨架染色评估细胞形态,活死染色和CCK-8法检测细胞活性、增殖情况;②采用不同浓度(0,0.5,1,2 mmol/L)的10-羟基-2-癸烯酸培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导分化后,碱性磷酸酶染色和茜素红染色评估成骨分化情况,Western blot和免疫荧光染色分析成骨相关蛋白表达;③诱导小鼠骨髓单个核细胞分化为巨噬细胞,分别加入含不同浓度(0,0.5,1,2 mmol/L)10-羟基-2-癸烯酸的破骨诱导分化培养基,抗酒石酸酸性磷酸酶和F-actin染色检测破骨细胞生成情况;④将大鼠骨髓间充质干细胞饥饿培养6 h后常规培养,并分组:对照组(不进行任何干预)、10-羟基-2-癸烯酸组、10-羟基-2-癸烯酸+AS1842856组、10-羟基-2-癸烯酸+EX-527组,10-羟基-2-癸烯酸干预浓度为0.5 mmol/L,AS1842856为叉头框转录因子O1抑制剂,EX-527为沉默调节蛋白1抑制剂,Western blot和免疫荧光染色分析沉默调节蛋白1/叉头框转录因子O1通路激活情况以及自噬、成骨相关蛋白表达;⑤将大鼠骨髓间充质干细胞分组培养:对照组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+10-羟基-2-癸烯酸组,10-羟基-2-癸烯酸干预浓度为0.5 mmol/L,H_(2)O_(2)干预24 h后进行对应的药物干预,成骨诱导后分别进行碱性磷酸酶与茜素红染色;⑥将大鼠骨髓间充质干细胞分5组培养:对照组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+10-羟基-2-癸烯酸组、H_(2)O_(2)+10-羟基-2-癸烯酸+AS1842856组、H_(2)O_(2)+10-羟基-2-癸烯酸+EX-527组,10-羟基-2-癸烯酸干预浓度为0.5 mmol/L,H_(2)O_(2)干预24 h后进行对应的药物干预,Western blot检测沉默调节蛋白1/叉头框转录因子O1信号通路与抗氧化相关蛋白表达,TUNEL染色和β-半乳糖苷酶染色评估细胞凋亡和衰老情况。结果与结论:①细胞骨架染色、活死染色和CCK-8检测显示,0.5,1,2 mmol/L 10-羟基-2-癸烯酸可促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖,后续实验选择该3种干预浓度;②碱性磷酸酶、茜素红染色与Western blot和免疫荧光染色分析显示,0.5 mmol/L 10-羟基-2-癸烯酸可促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化与矿化,提升成骨相关蛋白表达;③抗酒石酸酸性磷酸酶和F-actin染色显示,0.5 mmol/L 10-羟基-2-癸烯酸可显着抑制破骨细胞的生成;④Western blot和免疫荧光染色显示,10-羟基-2-癸烯酸可激活沉默调节蛋白1/叉头框转录因子O1信号通路促进叉头框转录因子O1去乙酰化及其核转位,上调自噬相关蛋白和抗氧化酶的表达;⑤碱性磷酸酶与茜素红染色显示,在氧化应激状态下,10-羟基-2-癸烯酸可促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化与矿化;⑥Western blot检测显示,在氧化应激状态下,10-羟基-2-癸烯酸可通过激活沉默调节蛋白1/叉头框转录因子O1信号通路增强大鼠骨髓间充质干细胞的抗氧化能力。TUNEL染色和β-半乳糖苷酶染色显示,在氧化应激状态下,10-羟基-2-癸烯酸可通过激活沉默调节蛋白1/叉头框转录因子O1信号通路减少大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡与衰老。结果表明,10-羟基-2-癸烯酸通过调控沉默调节蛋白1/叉头框转录因子O1信号通路增强自噬与抗氧化能力,进而促进成骨分化。