串联表达传染性脾肾坏死病毒4个保护性抗原基因的重组腺病毒构建OA

为了提高传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)主要保护性蛋白的表达,提高免疫保护效果,分别将ISKNV的主要保护性蛋白基因MCP、ORF24、ORF86和ORF93等进行克隆和串联,插入腺病毒载体后构建重组腺病毒。通过生物信息学工具分析ISKNV的MCP、ORF24、ORF86和ORF93这4个已经证实为有效保护性抗原基因的等电点、脂肪族氨基酸指数、总平均亲水性以及跨膜结构,初步验证抗原基因的基本特征,通过引入模拟酶切位点,将串联后的MCP、ORF24、ORF86和ORF93基因命名为MORF,进一步分析MORF蛋白的跨膜结构、三维空间结构以及抗原表位,证实串联后的MORF重组蛋白不影响原单个蛋白的空间结构和抗原表位的展示,说明此基因串联表达的方案可行。然后,采用PCR方法从病料中分别克隆MCP、ORF24、ORF86和ORF93基因,并按照模拟设计的酶切位点串联克隆至腺病毒穿梭载体pAd-CMV中,用PmeⅠ酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的BJ 5183感受态大肠埃希氏菌中,构建重组腺病毒骨架质粒,用PacⅠ酶切后转染至人胚胎肾细胞(HEK-293)包装重组腺病毒。结果表明,通过绿色荧光蛋白GFP的表达说明重组腺病毒包装成功,通过Western blot检测到MORF蛋白的表达并具有反应原性。重组腺病毒静置培养滴度为6×10~8 pfu/mL,滴度较高。综上所述,通过生物学工具分析串联后的传染性脾肾坏死病毒保护性蛋白的跨膜结构、空间结构、抗原表位等信息,用于指导疫苗构建,进一步构建了表达串联MORF蛋白的重组腺病毒,为传染性脾肾坏死病毒多基因重组疫苗的研制奠定基础。