欧前胡素通过AMPK/SIRT1/PGC-1α通路促白色脂肪棕色化OA

[目的]通过网络药理学筛选促白色脂肪棕色化的中药单体,评价活性并探究其作用机制。[方法]1)中药单体的筛选:用GEO2R分析处理一周与五周冷暴露下C57BL/6小鼠皮下白色脂肪的差异基因,筛选出交集差异基因(DEGs);建立蛋白相互作用图谱,筛选核心(Hub)基因;ITCM平台预测可调控hub基因的中药单体,给予10μmol/L不同药物诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,实时荧光定量PCR法(RT-PCR)筛选对产热基因表达上调效果最强的中药单体。2)中药单体的生物学活性评价与机制研究:最优单体干预细胞后,CCK8法检测细胞活力,油红O染色观察细胞脂肪蓄积情况;免疫荧光定量解偶联蛋白1(Ucp1)表达;线粒体红色荧光(Mito-tracker-Red)探针检测线粒体数量;RT-PCR法和免疫蛋白印迹(Western blot)法检测棕色化基因蛋白水平变化;加入AMP活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂多索吗啡验证单体是否通过激活AMP活化蛋白激酶/沉默信息调节因子2同源蛋白1/过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(AMPK/SIRT1/PGC-1α)途径发挥产热作用。将8周龄雄性C57BL/6小鼠分为对照组、低剂量组,高剂量组、2周冷暴露组,给药28天后眼眶取血,检测血清中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。分离腹股沟白色脂肪(iWAT),苏木精-伊红(HE)染色与UCP1免疫组化观察组织形态学,RT-PCR实验、Western blot实验测定相关通路基因和蛋白的表达变化;平行一组-15℃暴露测定其生存时间。[结果]网络药理学筛选出的五个中药单体干预细胞后,对产热基因表达上调效果最强的是欧前胡素(IMP)。CCK8法筛选出IMP最优浓度10μmol/L,IMP干预后脂肪细胞内脂滴含量减少,UCP1表达量与线粒体数量显著上调(P<0.01);线粒体生物合成基因核呼吸因子1(Nrf1)、线粒体转录因子A(Tfam)与米色特异性基因Cbp/P300相互作用转录激活因子1(Cited1)、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(Cd137)、跨膜蛋白26(Tmem26)、Ⅱ型脱碘酶(Dio2)(P<0.05)表达显著上调;在1、3、10μmol/L浓度下,IMP呈剂量依赖性促进产热基因UCP1、PR结构域蛋白16(PRDM16)、PGC-1α(P<0.05)和产热、脂肪酸氧化过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)蛋白以及AMPK通路蛋白P-AMPK、SIRT1的表达,抑制脂质合成基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)的表达;AMPK抑制剂可阻断IMP对棕色化脂肪的作用。IMP干预后小鼠TG、TC、LDL-C低于对照组,HDL-C高于对照组,iWAT中脂滴形态相对变小,高剂量组UCP1阳性细胞数量显著增多(P<0.01),高剂量IMP显著上调UCP1、PGC-1α基因和蛋白表达、AMPK通路蛋白表达,下调PPARγ蛋白表达(P<0.05)。低剂量IMP可显著延长-15℃小鼠的生存时间(P<0.01)。[结论]1)通过网络药理学可预测促进脂肪细胞棕色化的中药单体。2)IMP可促进白色脂肪棕色化,有效延长了小鼠在极寒温度下的存活时间。3)IMP促白色脂肪棕色化通过调控AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路实现。