敲减核蛋白1可激活iNOS/ONOO^(-)信号通路并促进小鼠早期肾损伤OA

目的:探讨敲减核蛋白1(nuclear protein 1,Nupr1)是否通过激活诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)/过氧亚硝酸阴离子(peroxynitrite,ONOO^(-))信号通路促进小鼠早期肾损伤。方法:24只C57BL/6小鼠经肾脏多位点注射腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)构建肾组织Nupr1敲减的小鼠模型,分为假手术(sham)组、AAV对照(AAV-Con)组和Nupr1敲减(AAV-sh Nupr1)组,每组8只。细胞实验使用人近端肾小管上皮HK-2细胞,通过病毒转染法构建Nupr1过表达及其对照(HK2-oe Nupr1和HK2-oeWT)细胞株和Nupr1敲减及其载体对照(HK2-sh Nupr1和HK2-shWT)细胞株,各细胞株予以H_(2)O_(2)处理0和24 h;HK2-sh Nupr1细胞株再分别加入iNOS抑制剂1400W或活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)。HE染色观察肾组织形态;Western blot实验检测Nupr1、iNOS和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3的蛋白表达水平;ELISA和酶标比色法检测血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、炎症因子(肿瘤坏死因子α和白细胞介素6)、脂质过氧标志物[脂质过氧化物(lipid peroxide,LPO)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)],以及ONOO⁻水平(即总硝酸盐含量)。结果:动物实验显示,sham组和AAV-Con组小鼠肾组织并无异常;与AAV-Con组相比,AAV-sh Nupr1小鼠出现显著肾损伤,表现为肾小球肥大且细胞密度异常增高,肾小管间质炎症细胞浸润,肾小管管腔扩张和上皮细胞脱落,BUN升高(P<0.01),iNOS/ONOO^(-)信号通路激活(P<0.01),炎症因子升高(P<0.01),脂质过氧化(LPO和MDA含量增多,SOD活性降低;P<0.01)。细胞实验显示,与对照(control,Con)组相比,oeWT组和shWT组HK-2细胞并无显著改变(P>0.05);与各自对照组(Con组、oeWT组和shWT组)相比,H_(2)O_(2)组、oeWT+H_(2)O_(2)组和shWT+H_(2)O_(2)组均显著诱导Nupr1表达增加(P<0.01),iNOS/ONOO^(-)信号通路激活(P<0.01),脂质过氧化和炎症反应增强(P<0.01);相对于oeWT+H_(2)O_(2)组,过表达Nupr1(oe Nupr1+H_(2)O_(2)组)则显著抑制由H_(2)O_(2)诱导的上述损伤性反应(P<0.01);与之相反的是,相对于shWT+H_(2)O_(2)组,敲减Nupr1(sh Nupr1+H_(2)O_(2)组)则加剧由H_(2)O_(2)诱导的上述损伤性反应。同时,与shWT组相比,sh Nupr1组细胞的iNOS/ONOO^(-)信号通路显著激活(P<0.01),炎症指标和脂质过氧化指标也显著增加(P<0.01);使用iNOS抑制剂1400W和抗氧化剂NAC均可显著减轻Nupr1敲减诱导的细胞损伤(P<0.01)。结论:敲减Nupr1可通过激活iNOS/ONOO^(-)信号通路促进小鼠早期肾损伤。