基于“序列-结构-机理”的计算机辅助DAEase新序列挖掘OA

为丰富D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase,DAEase)家族成员,采用序列比对、同源建模、分子对接、蛋白表达、酶活检测等方法,建立基于“序列-结构-机理”的计算机辅助DAEase挖掘新策略,成功筛选到DAEase新序列并对其进行表征。利用模板探针从NCBI数据库中筛选同源序列,根据对接质量、关键氨基酸数量、底物氢键个数及催化机理对候选序列进行综合评分;合成不同分值的DAEase候选序列进行表达验证,发现2个高分候选序列具备明显DAEase催化活性,而3个低分候选序列催化活性极低,与预测相吻合。对活性较高的来源于厚壁细菌(Firmicutes bacterium)HGW的DAEase(Fbh-DAEase)进行表征,结果显示:Fbh-DAEase为非金属离子依赖酶,其最适反应pH为6.5;最适温度为55℃,45、50、55℃的半衰期分别为3.9、2.3、1.7 h;最适反应条件下Fbh-DAEase的比活力达到254.3 U/mg。以500 g/L D-果糖为底物时,Fbh-DAEase催化反应8 h后D-阿洛酮糖产量达到137.8 g/L,转化率为27.56%。与现有DAEase相比,Fbh-DAEase的比活力和热稳定性都达到较高水平,且最适pH为弱酸性,具有一定的应用价值。