2,4-二硝基氟苯诱导特应性皮炎氧化应激模型的建立及评价OA

目的应用2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)涂抹KM小鼠背部及耳后皮肤,建立特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)氧化应激小鼠模型,以评价晚期糖基化终末产物受体-核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族pyrin域包含蛋白3轴(receptor for advanced glycation end products-NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3 axis,RAGE-NLRP3 axis)在AD氧化应激中的调控作用,从而为AD提供潜在的治疗靶点。方法选取20只SPF级雌性KM小鼠,随机分为对照组(Control)和实验组(DNFB),每组10只。Control组小鼠背部和耳后涂抹丙酮-橄榄油基质(丙酮∶橄榄油=3∶1),DNFB组小鼠背部和耳后涂抹0.5%DNFB(按100 mL丙酮-橄榄油基质加入0.5 g DNFB比例配制),每日1次,连续14 d。分别在处理后第2、4、6、9、12、14天时对小鼠的皮损症状严重程度进行评分,并在处理第14天时对小鼠的搔抓行为和耳缘厚度进行评价。实验结束当天,用游标卡尺测量小鼠双耳厚度,测量3次取平均值,以评估耳部肿胀程度。经HE染色来观测各组小鼠背部皮肤组织内的细胞形态和结构变化。通过实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法和免疫组织化学染色法来检测各组小鼠皮肤组织中RAGE mRNA和蛋白的表达情况。并用实时荧光定量PCR法检测氧化应激相关分子NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteine-dependent aspartate-specific protease 1,caspase-1)、白细胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)的mRNA表达变化。结果处理第14天,Control组和DNFB组小鼠背部皮损评分分别为(0.20±0.42)分和(9.93±1.30)分(P<0.0001),小鼠搔抓行为评分分别为(5.00±2.05)次和(49.26±8.49)次(P<0.0001),耳缘厚度分别为(213.00±11.87)µm和(765.93±140.47)µm(P<0.0001);DNFB组小鼠背部处置部位皮肤出现明显干燥、脱屑、增厚等情况。HE染色结果显示,DNFB组小鼠皮肤炎症反应明显,符合AD的病理特征。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹结果显示,与Control组相比,DNFB组小鼠皮肤组织中RAGE mRNA表达水平明显增加(P<0.05),RAGE蛋白表达水平也明显增加(P<0.01)。免疫组织化学染色结果显示,与Control组相比,DNFB组小鼠皮肤组织角质层增厚,间质内成纤维细胞纤维化增生,RAGE蛋白在小鼠皮肤组织中明显增加(P<0.01)。实时荧光定量PCR检测结果显示,DNFB组小鼠皮肤组织中NLRP3、caspase-1和IL-1βmRNA表达水平均明显增加(P<0.01)。结论通过涂抹DNFB成功构建了AD小鼠氧化应激模型。该模型提示,RAGE可能通过调控NLRP3炎症小体与IL-1β释放,形成氧化-炎症级联反应,从而促进AD发生。这表明,RAGE可能是AD治疗的潜在靶点。