靶向小菜蛾PxGNBP3的RNAi增效绿僵菌构建及其免疫调控机制OA

【目的】革兰氏阴性菌识别蛋白(Gram-negative binding protein,GNBP),又称β-1,3-葡聚糖识别蛋白,是昆虫中一类重要的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR),在先天免疫过程中发挥关键作用。本研究旨在系统鉴定小菜蛾(Plutella xylostella)GNBP基因家族成员,分析其结构特征与表达模式,筛选并验证关键靶基因,以期揭示小菜蛾应对病原侵染的先天免疫机制与进化适应,为开发新型生物防治策略提供理论依据与潜在靶点。【方法】基于小菜蛾全基因组数据,对GNBP基因家族成员进行鉴定;综合利用生物信息学方法分析其结构特征与进化关系,并采用AlphaFold3预测其三维结构。此外,结合公共转录组数据与实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术,检测该家族成员在不同组织以及白僵菌(Beauveria bassiana)和金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)侵染后的表达模式。构建携带pSilent-PxGNBP3的重组绿僵菌,并通过RT-qPCR检测侵染后PxGNBP3及下游抗菌肽基因的表达水平,同时利用生物测定评估不同菌株对小菜蛾的致病力。【结果】共鉴定出10个小菜蛾PxGNBP,其中PxβGRP4位于22号染色体,属于葡聚糖酶亚家族;其余9个成员位于29号染色体,属于PRR亚家族。系统进化及染色体定位分析表明该家族存在串联重复现象。保守基序分析显示,PxGNBP的N端结构域保守性低于C端;除PxβGRP4外,其余成员的葡聚糖酶关键催化位点均发生突变。三维结构预测结果表明,除PxβGRP4和PxβGRP3外,其余成员均具有典型GNBP蛋白结构;PxβGRP3的C端存在一个与Carbohydrate-binding module 39(CBM39)相似但不同的结构片段。表达谱分析发现,大多数成员在两种真菌侵染后均呈现先上升后下降的时序表达模式。RNA干扰(RNAi)试验表明,重组绿僵菌能够有效抑制PxGNBP3的表达,从而导致抗菌肽表达水平显著下降及宿主存活率降低;且重组菌株的毒力显著高于野生型,并随浓度升高而增强。【结论】鉴定出小菜蛾10个GNBP家族成员,PxβGRP3和PxGNBP3-2在结构上具有特殊性;该家族在真菌侵染中呈现时序性调控表达模式;利用构建重组绿僵菌方式成功实现了对PxGNBP3的体内RNAi功能验证。研究结果可为阐明小菜蛾先天免疫机制及开发新型生物防治靶标提供重要依据。