独活治疗膝骨关节炎作用机制的网络药理学与体外试验研究OA

目的探讨独活治疗膝骨关节炎(KOA)的作用机制。方法通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)检索并筛选独活的活性成分,通过Stitch,GeneCards,SymMap,CTD数据库获取活性成分的靶点,通过GeneCards,OMIM,DrugBank数据库获取KOA相关疾病靶点,通过在线维恩图谱平台筛选独活和KOA的共有靶点;通过Cytoscape_v3.9.1软件构建药物-活性成分-疾病-靶点网络;将活性成分与疾病的共有靶点导入String数据库进行蛋白-蛋白互作(PPI)网络分析,通过Cytohubba中的最大集团中心度(MCC)算法筛选排名前10的核心靶点;通过DAVID数据库进行基因本体论(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,获取独活治疗KOA的靶点和信号通路,采用Hiplot网络服务进行可视化分析;通过AutoDock Tools v1.5.7软件进行分子对接验证。将人软骨细胞株C28/I2分为空白组[A组,0 ng/mL白细胞介素1β(IL-1β)+0µmol/L二氢欧山芹醇乙酸酯(CBA)],模型组(B组,10 ng/mL IL-1β),不同浓度CBA治疗组(C组、D组、E组、F组,10 ng/mL IL-1β+5,10,20,40µmol/L CBA),各组处理48 h后,采用CCK-8法检测细胞活力;选取能有效抑制IL-1β诱导的C28/I2细胞活力下降的2个CBA浓度分别作为低、高剂量组,采用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测核心靶点mRNA的表达水平。结果共筛选出CBA、紫花前胡苷、当归醇G等8种活性成分,2970个潜在疾病靶点,活性成分-疾病共有靶点112个,其中肿瘤坏死因子(TNF)、胱天蛋白酶3(CASP3)、白蛋白(Alb)、JUN、B细胞淋巴瘤2(Bcl2)、胰岛素(INS)、核因子-κB1(NF-κB1)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、IL-1β、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)为核心靶点。GO分析获得条目858个,包括生物过程657个,细胞组成81个,分子功能120个。KEGG通路富集分析共富集到156条信号通路,主要涉及脂质和动脉粥样硬化、细胞凋亡、TNF、白细胞介素17(IL-17)等信号通路。分子对接结果显示,CBA与各核心靶点(除INS外)的自发结合能均较强(<-5.0 kcal/mol)。体外试验结果显示,与B组比较,C组、D组、E组的细胞活力均显著升高(P<0.001),而F组无显著变化(P>0.05)。选取5,20µmol/L CBA分别作为低、高剂量组(C组和E组)检测核心靶点mRNA表达水平。结果显示,与B组比较,E组TNF mRNA的表达水平显著降低(P<0.01);C组和E组JUN,PTGS2,NF-κB1,CASP3 mRNA的表达水平均显著降低(P<0.05),Bcl2 mRNA的表达水平均显著升高(P<0.05)。结论独活可能通过CBA等活性成分作用于TNF,CASP3,JUN,Bcl2,NF-κB1,PTGS2等潜在靶点,调控细胞凋亡、IL-17、TNF等信号通路,从而发挥治疗KOA的作用。