猫传染性腹膜炎病毒RdRp复合物的表达纯化及酶活性验证OA

猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus,FIPV)的非结构蛋白(non structure protein,NSP)12是RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)核心组分,但其与辅助因子NSP7、NSP8之间的相互作用以及RdRp复合体的功能尚不清楚。本研究旨在分析NSP12的分子特征,探究其与NSP7、NSP8的相互作用,并验证RdRp复合体的酶活性。首先,采用生物信息学方法预测NSP12的理化性质及结构特征。为探究FIPV RdRp复合物中NSP7、NSP8和NSP12之间的相互作用,构建了pcDNA3.1-Flag-NSP7,pcDNA3.1-HA-NSP8和pcDNA3.1-Myc-NSP12质粒,转染至293T细胞后,利用免疫共沉淀(co-inmunoprecipitation,Co-IP)、蛋白质体外结合(Pull-down)和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测蛋白互作及共定位。其次,利用PCR扩增FIPV的NSP7、NSP8和NSP12基因,并将其分别同源重组至pET-30α载体,构建原核表达重组质粒。进一步优化诱导表达条件,采用镍柱亲和层析纯化蛋白,并通过超滤管浓缩获得RdRp复合物。最后,建立FIPV RdRp体外RNA延伸体系,并基于凝胶方法检测RdRp复合物的酶活性。生物信息学分析表明,NSP12为稳定的亲水性蛋白,包含43.51%的α螺旋、45.02%的无规则卷曲以及90个潜在磷酸化位点。Co-IP、Pull-down和IFA试验证实,在293T细胞中NSP7、NSP8与NSP12之间存在相互作用并发生共定位。原核表达结果显示,NSP7和NSP8蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量为10和23 ku,NSP12则以可溶性蛋白形式表达,相对分子质量为105 ku。酶活性试验结果表明,RdRp复合物能够延伸RNA模板链,而单独的NSP12则无此活性。本研究通过原核表达纯化了FIPV RdRp复合物,并建立了体外酶活性检测体系。首次证实FIPV-DF2毒株的NSP12需与NSP7、NSP8形成复合体才能发挥RdRp功能,为进一步探究FIPV RdRp的生物学功能及开发靶向RdRp的抗病毒药物奠定基础。