鹿蹄草素对产肠毒素大肠杆菌的抑菌效果及作用机制OA

为了探究鹿蹄草素对产肠毒素大肠杆菌(enterotoxingenic Escherichia coli,ETEC)的抑菌效果及其作用机制,试验采用微量肉汤稀释法测定鹿蹄草素及抗生素对ETEC K99菌株的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC),采用时间-杀菌动力学曲线研究鹿蹄草素(128,256,512μg/mL)对ETEC K99菌株的杀菌活性,采用结晶紫染色法定量分析鹿蹄草素(16,32,64,128,256μg/mL)对ETEC K99菌株生物被膜形成的影响,采用ATP检测试剂盒评估鹿蹄草素(32,64,128,256μg/mL)对ETEC K99菌株细胞膜通透性的影响,利用体外细胞模型评估鹿蹄草素(64,128,256μg/mL)对ETEC K99菌株黏附与侵入能力的影响,采用分子对接技术预测鹿蹄草素作用ETEC K99菌株的靶点。结果表明:磺胺异口恶唑对大肠杆菌抑制作用弱,鹿蹄草素对大肠杆菌有抑制效果,且使用512μg/mL鹿蹄草素处理ETEC K99菌株4 h后,细菌被完全杀死,鹿蹄草素对ETEC K99菌株在体外有直接抑制和杀灭作用,且抑菌作用呈剂量依赖性。当鹿蹄草素质量浓度≥32μg/mL时,可显著或极显著降低ETEC K99菌株生物被膜的OD590值(P<0.05或P<0.001、P<0.0001),其最低有效抑制质量浓度为32μg/mL。与阴性对照(只添加菌液)相比,鹿蹄草素质量浓度为32~256μg/mL时荧光强度极显著降低(P<0.01、P<0.000 1),说明鹿蹄草素能够通过剂量依赖方式增加ETEC K99菌株内膜通透性,导致胞内ATP外泄;当鹿蹄草素质量浓度为64,128μg/mL时,荧光强度显著增强(P<0.05);鹿蹄草质量浓度为128μg/mL时,荧光强度极显著增强(P<0.001)。高质量浓度鹿蹄草素可显著破坏细菌外膜完整性。鹿蹄草素质量浓度为64μg/mL时,细胞表面黏附的活菌数减少22.4%(P<0.05),细胞内侵袭菌数减少36.8%(P<0.01);鹿蹄草素质量浓度为128,256μg/mL时,细胞表面黏附的活菌数分别减少63.8%(P<0.001)和79.8%(P<0.000 1),细胞内侵袭菌数分别减少51.3%(P<0.01)和66.8%(P<0.01)。ETEC K99的纤毛蛋白FanA可能通过π-氢键(自由结合能-17.39 kJ/mol)与鹿蹄草素结合。说明鹿蹄草素可能通过改变ETEC膜的通透性、抑制其生物被膜形成及干扰黏附侵袭功能等多途径发挥抑菌作用。