恒古骨伤愈合剂调节AGEs-RAGE通路抑制铁死亡改善膝骨关节炎OA

目的探究恒古骨伤愈合剂(OK)调节铁死亡,改善膝骨关节炎(KOA)的机制。方法通过网络药理学分析OK、KOA和铁死亡相关的靶基因,进行KEGG通路富集分析。采用10 mg/L的白细胞介素(IL)-1β诱导人C28/I2细胞模拟关节炎体外模型,分为对照(Control)组、模型(IL-1β)组、恒古骨伤愈合剂(IL-1β+OK)组、晚期糖基化终末产物(IL-1β+OK+AGEs)组、铁死亡抑制剂(IL-1β+Fer-1)组、联合治疗(IL-1β+OK+Fer-1)组。ELISA试剂盒检测细胞上清液炎性因子IL-6和氧化应激因子丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH);细胞专用Fe2+试剂盒检测各组细胞的含量;Western blot检测细胞外基质降解蛋白(MMP13)、软骨基质合成蛋白2(COLA2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员(SLC)蛋白;体内实验使用内侧半月板失稳术构建大鼠KOA模型,设置假手术(sham)组、造模(DMM)组和给药(OK)组,按照分组情况灌胃相应的药物8周;用热板仪、压力测痛仪分别记录各组大鼠的缩爪反应时间(s)和所承受的砝码重量(g);ELISA试剂盒检测大鼠血清炎性因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、IL-6和氧化应激因子MDA、SOD、GSH、活性氧(ROS);伊红-苏木精、番红-固绿和甲苯胺蓝染色大鼠膝关节,并依OARSI标准对软骨组织退变程度评分;Western blot检测大鼠细骨关节软骨MMP13、COLA2、GPX4、SLC、晚期糖基化终末产物(AGEs)及其受体(RAGE)蛋白的表达。结果网络药理学分析发现AGEs-RAGE信号通路等可能是OK作用于KOA和铁死亡的关键通路。细胞实验中,IL-1β组的MDA、IL-6和Fe2+升高(P<0.05,P<0.01),GSH和SOD水平降低(P<0.05,P<0.01);MMP13蛋白水平升高(P<0.05),而COLA2、GPX4和SLC蛋白水平降低(P<0.01)。OK干预逆转以上结果,而AGEs消弱OK的作用。此外,OK进一步增强铁死亡抑制剂Fer-1对C28/I2细胞的抗炎、抗氧化应激,改善代谢平衡的作用。动物实验中,DMM组大鼠压痛、热痛值和OARSI评分显著升高(P<0.01,P<0.001),膝关节软骨面和软骨基质损伤。与DMM组比较,OK显著降低大鼠的压痛、热痛和OARSI评分值(P<0.01),缓解膝关节软骨面和软骨基质损伤;OK组关节软骨COLA2、GPX4、SLC蛋白的表达显著增加(P<0.05),而MMP13、AGEs及受体RAGE的表达降低(P<0.05,P<0.01);OK组血清TNF-α、VEGF、IL-6、MDA、ROS显著降低(P<0.01),SOD和GSH升高(P<0.01)。结论OK能够通过AGEs-RAGE轴抑制铁死亡,保护关节软骨,进而发挥抗关节炎的作用。