赤羽病病毒间接免疫荧光检测方法的建立与应用OA

为建立赤羽病病毒(AKAV)的间接免疫荧光检测方法(IFA),本试验利用大肠杆菌原核表达系统将AKAV的N蛋白进行表达,蛋白纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,以AKAV感染后的BHK-21细胞作为抗原,小鼠抗N蛋白多克隆抗体为一抗,FITC-山羊抗小鼠Ig G为二抗,建立AKAV的IFA检测方法,优化筛选抗体的最佳孵育浓度和孵育时间,评估所建立方法的特异性、敏感性和重复性。最后,利用该方法对临床样品进行检测,并与荧光定量PCR方法进行符合性验证。结果显示,N蛋白可在大肠杆菌中高效表达,4次免疫小鼠后多克隆抗体效价可达1∶51200;经优化筛选,在一抗稀释浓度1∶200、孵育2 h,二抗稀释浓度1∶500、孵育1.5 h条件下,IFA检测效果最佳;敏感性试验显示,所建方法对25 TCID50的AKAV可有效检出;特异性试验显示与其他病原无交叉反应,且重复性良好。该方法对24份临床山羊血液样本进行检测,共检出8份阳性、16份阴性样本,与荧光定量PCR方法检测结果相比,二者的符合率为95.8%。本试验为AKAV实验室诊断技术及产品的开发提供了技术支持,同时为深入研究AKAV感染机制奠定了基础。