山柰酚调控线粒体自噬抑制大鼠椎间盘退变的作用机制OA

背景:在椎间盘退变发展过程中,氧化应激是导致椎间盘退变病程加速进展的主要因素之一。线粒体自噬在应对氧化应激、预防线粒体功能障碍及相关疾病中发挥了关键作用。前期研究证实,山柰酚能改善退变的髓核细胞的增殖活性、降低炎症水平,延缓大鼠椎间盘退变的进展。目的:探究山柰酚对退变椎间盘组织线粒体自噬的影响。方法:①动物实验:将15只SD大鼠随机分5组干预:除空白组(n=3)外,模型组(n=3)、山柰酚低剂量组(n=3)、山柰酚中剂量组(n=3)、山柰酚高剂量组(n=3)采用全层纤维环穿刺法构建尾椎椎间盘退变模型,术后4周,空白组、模型组给予生理盐水灌胃,山柰酚低、中、高剂量组分别给予25,50,100 mg/kg山柰酚灌胃,1次/d,连续给药8周。末次给药结束后取材,进行血清炎症因子水平与椎间盘MRI成像、苏木精-伊红染色检测。②细胞实验:将第2代大鼠髓核细胞分5组培养:空白组不加入任何药物,模型组加入H_(2)O_(2)(构建氧化应激损伤模型),山柰酚组加入H_(2)O_(2)处理24 h后再加入10μmol/L山柰酚,自噬抑制剂组加入H_(2)O_(2)处理24 h后再加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤,山柰酚+自噬抑制剂组加入H_(2)O_(2)处理24 h后再加入10μmol/L山柰酚+3-甲基腺嘌呤。继续培养24 h后,CCK-8法检测细胞存活率,Western blot检测炎症因子与自噬指标的蛋白表达,RT-qPCR检测炎症因子与自噬指标的基因表达,免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白表达,DCFH-DA荧光探针检测活性氧水平。结果与结论:①动物实验:相较于空白组,模型组大鼠血清白细胞介素1β、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α水平上升(P<0.05),山柰酚各剂量组3种炎症因子水平均降低(P<0.05),其中山柰酚中剂量组降低更明显。MRI成像、苏木精-伊红染色结果显示,与模型组相比,山柰酚各剂量组椎间盘退变病理特征显著改善,髓核轮廓更加清晰、连续,髓核细胞数量显著增加,其中山柰酚中剂量组改善更明显。②细胞实验:与模型组比较,山柰酚组细胞存活率、Ⅱ型胶原蛋白以及张力蛋白同源物诱导的蛋白激酶1、帕金蛋白的基因与蛋白表达均升高(P<0.05),活性氧水平以及白细胞介素1β、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α的基因与蛋白表达均降低(P<0.05),微管相关蛋白轻链3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达与微管相关蛋白轻链3B mRNA表达升高(P<0.05);3-甲基腺嘌呤可抑制山柰酚的上述作用。③结果表明,山柰酚可能通过调控线粒体自噬水平来缓解氧化应激损伤,延缓椎间盘退变的进展。