对虾病毒IHHNV介导的双启动子驱动的对虾CDK1基因表达载体的构建与表达研究OA

针对体外培养刀额新对虾(Metapenaeus ensis)细胞存在分裂停滞和难以连续传代的问题,本研究团队已建立了一种基于传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)基因组的基因转移与表达系统(pUC19-IHHNV-PH-GUS和Bacmid-VP28),但该系统尚未应用于介导永生性转化相关基因在对虾及其细胞中的转移。鉴于此,本研究将该系统中的GUS报告基因替换为EGFP报告基因,并插入对虾永生性转化相关基因——细胞周期蛋白依赖性激酶(Cell cycle protein-dependent kinase,CDK1),构建了病毒表达载体pUC19-IHHNV-PH-CDK1-P2A-EGFP。同时,为提高CDK1基因在对虾细胞中的表达效率,进一步引入对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的WSV249启动子,构建了双启动子病毒表达载体pUC19-IHHNV-PH-WSV249-CDK1-P2A-EGFP。利用昆虫病毒多角体蛋白(Polyhedrin,PH)基因作为启动子(PH启动子),通过Sf9细胞对PH启动子和WSV249启动子的活性进行分析,结果表明,WSV249启动子可以在Sf9细胞中有效驱动基因的表达,但其活性显著低于PH启动子。进一步,将上述2种病毒表达载体分别与Bacmid-VP28质粒共转染至Sf9细胞中,从而发现所包装出的混合病毒能够有效感染对虾体外培养血淋巴细胞和造血组织细胞及对虾成体组织,且含双启动子PH-WSV249的混合病毒的感染效率更高。然而病毒感染后的对虾细胞存活能力有限,未在其中观察到明显的促进细胞增殖现象,本研究怀疑该现象与包装出的IHHNV会对细胞产生毒害作用有关。总之,本研究优化并构建了高效的对虾基因病毒表达载体,并验证了其在对虾及其细胞中的基因转移潜力。