基于CRISPR/Cas12a基因转化的条斑紫菜基因编辑底盘藻株构建OA北大核心
Construction of a Pyropia yezoensis strain as a gene-editing chassis using CRISPR/Cas12a
CRISPR/Cas系统是新一代基因编辑技术的代表,CRISPR/Cas12a系统具有蛋白分子量小、组装简单、脱靶率低等优势.本研究首先根据条斑紫菜密码子偏好性优化获得了PyCas12a基因序列,并在潮霉素抗性标记基因 PyAph7 前添加了可被 CRISPR/Cas12a 识别的 PAM 位点,借助原核表达获得Cas12a 蛋白,通过细胞外切割实验验证了其核酸内切酶对潮霉素抗性基因的剪切活性.之后以条斑紫菜(Pyropia yezoensis)叶状体为材料,利用基因枪转化,筛选获得阳性藻株.经基因组鉴定,获得转入了Cas12a核酸酶基因的条斑紫菜基因转化藻株 4 株,转录组水平鉴定其中 3 株存在稳定表达.本研究不仅为条斑紫菜功能基因的探索提供了理想材料,也为基于 CRISPR/Cas12a 基因编辑系统的条斑紫菜良种培育奠定了基础,在基础研究与应用研究方面均具有重要意义及广阔应用前景.
The CRISPR/Cas system represents a new generation of gene editing technology.The CRISPR/Cas12a system has the advantages of small protein molecular weight,simple assembly,and a low off-target rate.In this study,we sequence-optimized PyCas12a from Pyropia yezoensis based on the codon usage bias.We also added a PAM site that can be recognized by the CRISPR/Cas12a system upstream of the hygromycin B resistance marker gene PyAph7.The Cas12a protein was obtained by prokaryotic expression,and its PyAph7 cleavage activity was verified by an extracellular experiment.Then,the thallus of P.yezoensis was used as receptor material and trans-formed with PyCas12a employing a gene gun;hygromycin B-resistant thalli were selected.Genome identification was employed to confirm four transgenic alga strains.Transcriptomics confirmed that PyCas12a was stably ex-pressed in three of them.Our work not only identifies P.yezoensis as an ideal material for the functional explora-tion of genes but also lays a foundation for excellent P.yezoensis germplasms amenable to the CRISPR/Cas12a gene editing system.These findings are of great significance and have broad application prospects in basic and ap-plied research.
王淑瑞;郇丽;顾文辉;王旭雷;牛建峰;王广策
中国科学院海洋研究所 中国科学院暨山东省实验海洋生物学重点实验室,山东 青岛 266404||水产品种创制与高效养殖重点实验室(中国科学院),山东 青岛 266404||中国科学院大学,北京 100049中国科学院海洋研究所 中国科学院暨山东省实验海洋生物学重点实验室,山东 青岛 266404||水产品种创制与高效养殖重点实验室(中国科学院),山东 青岛 266404中国科学院海洋研究所 中国科学院暨山东省实验海洋生物学重点实验室,山东 青岛 266404||水产品种创制与高效养殖重点实验室(中国科学院),山东 青岛 266404中国科学院海洋研究所 中国科学院暨山东省实验海洋生物学重点实验室,山东 青岛 266404||水产品种创制与高效养殖重点实验室(中国科学院),山东 青岛 266404中国科学院海洋研究所 中国科学院暨山东省实验海洋生物学重点实验室,山东 青岛 266404||水产品种创制与高效养殖重点实验室(中国科学院),山东 青岛 266404中国科学院海洋研究所 中国科学院暨山东省实验海洋生物学重点实验室,山东 青岛 266404||青岛海洋科技中心海洋生物学与生物技术功能实验室,山东 青岛 266237||水产品种创制与高效养殖重点实验室(中国科学院),山东 青岛 266404
生物科学
CRISPR/Cas12a条斑紫菜(Pyropia yezoensis)原核表达细胞外切割细胞内表达
CRISPR/Cas12aPyropia yezoensisprokaryotic expressionextracellular cleavageintracellular expression
《海洋科学》 2025 (5)
34-46,13
山东省重点研发计划(重大科技创新工程)项目(2022LZGC004)山东省"泰山学者"工程专项经费资助项目(tspd20210316)青岛市自然科学基金项目(24-4-4-zrjj-145-jch)山东省自然科学基金项目(ZR2024MD011)国家藻类产业技术体系项目(CARS-50)[Key Research and Development Program of Shandong Prov-ince,Major Scientific and Technological Innovation Project,No.2022LZGC004The Research Fund for the Taishan Scholar Project of Shandong Province,No.tspd20210316Qingdao Natural Science Founda-tion,No.24-4-4-zrjj-145-jchShandong Provincial Natural Science Foun-dation,No.ZR2024MD011Earmarked Fund for China Agriculture Re-search System,No.CARS-50]
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