C57BL/6小鼠骨髓来源巨噬细胞分离、培养、鉴定及M1/M2的极化诱导OA

背景:巨噬细胞极化在疾病治疗中展现出巨大的应用潜力,尤其是在癌症、炎症和自身免疫性疾病等领域。通过构建体外标准模型,可以为深入研究巨噬细胞极化机制奠定基础。目的:观察C57BL/6小鼠骨髓来源巨噬细胞的体外生长特征以及构建M1和M2型巨噬细胞极化标准化体外模型。方法:无菌分离C57BL/6小鼠股骨和胫骨,收集骨髓腔内容物,通过筛网过滤并进行红细胞裂解后,用含20 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的高糖DMEM培养基重悬,按照实验需求接种于6孔板中,在第7天分化为成熟的小鼠骨髓来源巨噬细胞(M0型),然后用100 ng/mL脂多糖诱导M1型巨噬细胞极化,20 ng/mL白细胞介素4诱导M2型巨噬细胞极化。使用流式细胞术和RT-qPCR检测不同极化状态下巨噬细胞相应标志物的表达,Westernblot检测M1型巨噬细胞标志性通路蛋白p-STAT1、STAT1和M2型巨噬细胞标志性通路蛋白p-STAT6、STAT6的表达。结果与结论:①20ng/mL巨噬细胞集落刺激因子刺激7d,流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物F4/80的阳性染色率达到98.1%;②骨髓来源巨噬细胞用100 ng/mL脂多糖刺激6 h后,F4/80和CD86的阳性染色率约为35%,RT-qPCR检测M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶、白细胞介素6、巨噬细胞炎性蛋白1α和单核细胞趋化蛋白1 mRNA表达均显著高于对照组(P<0.01);③骨髓来源巨噬细胞用20 ng/mL白细胞介素4刺激24 h后,CD206平均荧光强度明显升高,RT-qPCR检测M2型巨噬细胞标志物Chi3l3(Ym1)、白细胞介素10和精氨酸酶1 mRNA表达均显著高于对照组(P<0.01);④Western blot检测结果显示,脂多糖诱导的M1型巨噬细胞标志性通路蛋白p-STAT1显著激活;白细胞介素4诱导的M2型巨噬细胞标志性通路蛋白p-STAT6显著激活。以上结果表明,脂多糖和白细胞介素4分别有效诱导了骨髓来源巨噬细胞向M1型和M2型巨噬细胞极化。