RUNX1对奶牛乳腺上皮细胞间质转化的调节作用OACSTPCD

[目的]探究Runt相关转录因子1(RUNX1)对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)发生上皮细胞间质转化(EMT)的作用及机制。[方法]通过CCK-8法检测不同感染复数的热灭活金黄色葡萄球菌处理后对MAC-T细胞活力的影响;通过倒置显微镜观察经金黄色葡萄球菌处理后MAC-T细胞的形态变化。通过实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测金黄色葡萄球菌处理MAC-T细胞后,细胞中EMT标志分子(E钙黏蛋白(E-cadherin)、N钙黏蛋白(N-cadherin)、α平滑肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin))、TGF/Smad通路信号分子(TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4)和RUNX1的表达量变化情况;并比较了分别使用RUNX1和TGF-β特异性抑制剂前后细胞EMT标志分子、TGF/Smad通路信号分子和RUNX1的表达水平变化。[结果]不同浓度热灭活金黄色葡萄球菌处理72 h后,MAC-T细胞活力较24和48 h组均极显著下降(P<0.01),通过显微镜观察发现此时细胞出现漂浮死亡现象。因此后续观察细胞形态变化时设置时间为12、24、36和48 h。当用感染复数(MOI)为100热灭活金黄色葡萄球菌处理MAC-T细胞48 h后,细胞形态由上皮细胞典型的“鹅卵石”样转变为间质细胞的“长梭状”;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果发现,与正常细胞相比,EMT标志分子E-cadherin mRNA表达量极显著下调(P<0.01),Vimentin、α-SMA、N-cadherin、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4和RUNX1 mRNA表达量显著或极显著上调(P<0.01);且Vimentin、α-SMA、P-Smad2和RUNX1蛋白表达量明显上调。经LY2109761抑制剂处理后,与感染组相比,2个抑制剂组MAC-T细胞中Smad2、Smad3、Smad4、N-cadherin、Vimentin、α-SMA和RUNX1的mRNA表达量均极显著下调(P<0.01),E-cadherin mRNA表达量极显著上调(P<0.01);经抑制剂Ro5-3335处理后,MAC-T细胞形态未出现显著的间质细胞样变化;与感染组相比,2个抑制剂Ro5-3335组细胞中E-cadherin的mRNA表达量极显著上调(P<0.01),N-cadherin、Vimentin、α-SMA(除10μmol/L Ro5-3335抑制剂组α-SMA外)、TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad4的mRNA表达水平均极显著降低(P<0.01)。[结论]热灭活金黄色葡萄球菌处理MAC-T细胞48 h可激活TGF/Smad通路诱导MAC-T细胞发生EMT变化;RUNX1可通过介导TGF/Smad通路调节金黄色葡萄球菌诱导的MAC-T细胞EMT过程。