外来入侵昆虫长林小蠹快速鉴定方法

[目的]长林小蠹Hylurgus ligniperda是我国新发生的重要外来入侵种，在我国胶东半岛对日本黑松造成严重危害。由于长林小蠹具有危害重、防治难、扩散能力强等特点，对我国松树资源构成了严重威胁，因此，应及时开展检验检疫工作、加强早期监测与预警，遏制其在我国进一步扩散。然而，长林小蠹各虫态体型较小，特别是在幼期(卵、幼虫、蛹)，较难通过外部形态进行准确识别，迫切需要研发适用于各发育阶段的快速鉴定技术。[方法]基于种特异性引物PCR扩增(SS-PCR)与重组酶聚合酶扩增和侧流层析试纸条(RPA-LFD)技术，建立了两种长林小蠹快速鉴定方法。[结果]在掌握长林小蠹线粒体基因组结构与组成的基础上，通过分析长林小蠹及其他43种小蠹线粒体基因组的13个蛋白编码基因，分别构建了最大似然树和贝叶斯树，筛选了与长林小蠹亲缘关系最近的3种小蠹作为后续研发快速鉴定方法的非靶标物种；通过对13个蛋白编码基因进化速率分析，选择了线粒体基因COI、ND2、ND4、ND5为SS-PCR的靶标，分别设计了一对长林小蠹种特异性引物，建立了长林小蠹SS-PCR快速鉴定方法，其特异性和灵敏度良好，并可在2-3小时内完成；以长林小蠹的线粒体基因ND2为靶标，针对ND2基因的保守区域设计了1对RPA引物(HLRPAF/HLRPAR)和3条探针(P1、P2和P3)，经验证，其中P3探针性能稳定，灵敏度较高，能够准确识别不同地理种群和不同虫态的长林小蠹，适用于外来入侵昆虫精准快速鉴定，高灵敏度使该鉴定方法可DNA粗提取方法相结合来，能够在野外现场对长林小蠹各虫态进行准确鉴定，整个检测过程用时不足35分钟。[结论]本研究建立的两种长林小蠹快速鉴定方法均具有耗时短、操作简便、高特异性、高灵敏度的特点，可实现对长林小蠹各虫态快速、精准、高效地鉴定，能够满足实际需要，为外来入侵昆虫的精准快速鉴定提供了技术保障。