内生生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007菌株prn基因簇的功能研究

[目的]杨树溃疡病是一类危害严重的杨树枝干病害，该病害严重威胁着我国杨树产业的健康发展。吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007菌株是一株高效防治杨树溃疡病的内生生防细菌。我们开展了JK-SH007菌株群体感应(Quorum Sensing，QS)与prn基因簇(prnABCD)的相关研究，以明确QS系统对prn基因簇的调控作用以及prn基因簇的功能，为揭示QS系统介导该菌株的生防机制奠定基础，进而为杨树溃疡病的防治提供新思路。[方法]采用乙酸乙酯萃取法提取JK-SH007菌株的抗菌粗物质，结合内外标法，经高效液相色谱(HPLC)、质谱等技术鉴定该菌株产生的抗菌活性物质；利用转录组学技术及qPCR技术筛选出JK-SH007菌株QS系统下游调控的抗病相关差异基因；采用同源重组策略构建JK-SH007菌株prn基因簇4个组成基因的敲除突变体，分别从生长能力、抑菌能力、抗菌物质变化等方面，揭示JK-SH007菌株的QS系统对prn基因簇是否具有调控作用以及prn基因簇的功能。[结果]HPLC检测发现JK-SH007菌株发酵液的乙酸乙酯粗提物中不含硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin，PRN)，而是在6.500min出现一个高峰抗菌活性物质，该物质的[M+H]+为254.76，这与PRN的相对分子质量大小不符；该物质对杨树溃疡病病原真菌金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma)、拟茎点霉(Phomopsis macrospore)以及七叶树壳梭孢(Fusicoccum aesculi)具明显的抑制作用；转录组和qPCR结果显示，CepI/R、RpfF/R两个QS系统4个关键基因敲除株中的prn基因簇4个组成基因(prnA、prnB、prnC和prnD)表达量均下调；成功构建了prn基因簇4个基因的敲除突变体，各突变株与野生株相比，生长无明显变化，但在6.500min处抗菌物质产量均有所降低，而且对3种杨树溃疡病病原菌的抑菌能力均有所下降，其中JK-SH007∆prnB下降幅度最大，下降了19.62％。另外，prnA、prnB、prnC和prnD缺失后，4个突变株在24.284min处均出现新的高峰物质。[结论]JK-SH007菌株不产硝吡咯菌素，QS系统正调控该菌株的抑菌能力，prn基因簇与JK-SH007菌株产抗菌物质能力密切相关。该研究可为后续通过调控JK-SH007菌株QS系统提高菌株的抗病性提供基础，为杨树溃疡病的生物防治提供理论支持。总之，JK-SH007菌株的生防机制复杂，QS系统介导该菌株的生防分子机制还有待于进一步深入研究。