植原体致病因子导致枣疯病症状发生的分子机理研究

枣(Ziziphus jujuba)果实含糖量高，营养丰富，加工附加值高，栽培利用历史悠久，是我国重要的果树和经济林树种。枣疯病(Jujube Witches'Broom，JWB)是由枣疯病植原体(Candidatus Phytoplasma ziziphi)引起的传染性致死病害，感病树出现丛枝、小叶、黄化、花器变叶等病症，果实产量和品质下降，严重时整株枯死，严重威胁红枣产业高质量发展。植原体寄生于枣韧皮部组织的筛管细胞内，通过Sec分泌系统向周边细胞分泌致病因子蛋白，与枣细胞内的靶标蛋白互作，进而调控枣树体生长发育和防御系统，导致各种病症的发生。编码致病因子的基因常位于植原体基因组的潜在移动元件(Potential Mobile Unit，PMU)上，其蛋白含有N端信号肽等特征序列，没有跨膜区域，我们利用Signal P4.1软件分析预测信号肽，用TMHMM2.0预测跨膜区域，从枣疯病植原体基因组PMU中鉴定了8个潜在的致病因子，命名为Zaofeng1-Zaofeng8。将这些基因克隆到pSAK277载体上，分别转化进拟南芥和枣表达，导致了不同的症状发生。与野生型对照相比，表达Zaofeng6的拟南芥植株和枣组培芽均出现了丛枝、小叶的症状，在烟草叶片中的瞬时表达证明Zaofeng6引起ETI反应，酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补试验表明，Zaofeng6与枣ZjTCP7转录因子互作，利用Zaofeng6片段缺失突变体进行Y2H证明，其通过前两个α螺旋与ZjTCP7互作。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建zjtcp7沉默突变体，表现出与发病枣组培苗和表达Zaofeng6的组培芽相似的丛枝症状，Western-blot表明转化表达Zaofeng6和zjtcp7突变体的枣组培芽中ZjTCP7蛋白含量下降，qRT-PCR证明，ZjTCP7及其下游的ZjCCD7、ZjCCD8和ZjMAX2等独脚金内酯信号通路基因的表达下调，表明Zaofeng6通过与ZjTCP7互作，调控独脚金内酯信号通路，导致了丛枝症状的发生。在转化表达Zaofeng3的拟南芥和枣组培芽中，出现了生长迟缓、丛枝的现象，拟南芥出现花变叶症状。利用Zaofeng3片段缺失突变体转化拟南芥，发现诱导花变叶症状需要其3个α螺旋同时参与。Y2H和BiFC杂交表明，Zaofeng3与ZjMADS19、ZjMADS43、ZjMADS47、ZjMADS77和ZjTCP7等互作。对表达Zaofeng3的拟南芥开展转录组分析，有11个MADS转录因子表达量上调，13个出现下调。qRT-PCR也表明，转化表达Zaofeng3的枣组培苗里，ZjMADS19，ZjMADS47，ZjMADS77和ZjTCP7的表达下调，ZjMADS48的表达上调。烟草叶片共浸润瞬时表达试验表明，Zaofeng3显著降低了ZjMADS19，ZjMADS47，ZjMADS77和ZjTCP7的蛋白丰度。这些研究表明，Zaofeng3通过与枣MADS转录因子及ZjTCP7互作，导致了丛枝和花变叶症状发生。