中国松材线虫种群遗传分析和疫源追溯研究

由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的松材线虫病(pine wilt disease)是一种国际性重大森林病害，中国是松材线虫病流行危害最严重的地区。至2024年初我国已有18个省(自治区、直辖市)的663个县级行政区沦为松材线虫病疫区。由于松材线虫的入侵时间和入侵地环境的不同，导致我国松材线虫种群在遗传结构上形成了许多不同的地理株系。本研究主要是利用全基因组数据分析我国不同疫区松材线虫的种群遗传多样性，根据其遗传差异来探究我国各个疫区松材线虫的种群遗传结构，并建立松材线虫的遗传追溯体系，来追溯松材线虫的传播来源和扩散路径，为我国松材线虫的检疫、防控工作提供科学依据。主要研究结果如下： 1、本实验室自2014年到2024年实验室的虫株资源库中共收集保存701株松材线虫虫株资源。对701株虫株的重测序数据进行分析，共鉴定到9，508，393个SNPs位点。其中国外虫株的SNP总数、纯合子数、特有SNPs数、转换和颠换数量均高于国内大部分虫株。各省份间不同虫株的SNPs数量均存在明显的差异，SNPs的数量最多的是广东，其次是吉林，四川省SC、湖北HB、浙江ZJ、江西JX、湖南HN、云南YN、广西GX的虫株平均数均大于20万，而福建FJ、贵州GZ、安徽AH、甘肃GS、陕西SX、江苏JS、河南HEN、重庆CQ、辽宁LN、山东SD的虫株的SNPs数相对较小，均小于10万，其中最小的福建省；纯合子数与SNPs数情况相同，依旧是广东省虫株的纯合子数最多；而特有SNPs数中，最多的是云南省的虫株，有128，356，广东、湖北、四川、江西、广西的虫株的特有SNPs数也相对较多。SNP基因型种类共有12种：A→C，A→G，A→T，C→A，C→G，C→T，G→A，G→C，G→T，T→A，T→C和T→G。其中，A→G，C→T，G→A和T→C这四种类型的SNP要显著高于其他8个类型的SNP基因型。 2、对701个松材线虫虫株的SNP位点进行主成分分析(PCA)和系统发育树分析，可将其归为8个类群：类群1共计9个虫株，为日本虫株(C14-5)，美国虫株(USA01-06)和2株湖北虫株(HB36、HB37)；类群2共计41个虫株，包括广东虫株37株、湖南虫株3株和湖北虫株1株；类群3共有117个虫株，包括广东虫株22株，湖南省虫株1株，广西壮族自治区33株，湖北省16株，河南省虫株1株，江西省虫株11株，辽宁省虫株2株；云南省虫株4株，浙江省虫株27株；类群4共计47株，分别来自广东省的3株，广西壮族自治区9株，湖北省的5株，浙江省的8株，吉林省的7株，四川省的14株以及山东省的1株；类群5共计有虫株100株，包括广东省的45株，广西壮族自治区的7株，湖北省的1株，江西省的25株，辽宁省的1株，浙江省16株，四川省的3株，江苏省的2株；类群6共计有167株虫株，广东省的13株，广西壮族自治区的11株，湖北省虫株42株，河南省虫株2株，江西省虫株3株，辽宁省虫株9株，浙江省虫株30株，山东省16株，四川省虫株15株，陕西省虫株2株，江苏省虫株12株，安徽省虫株5株，福建省虫株3株，重庆市3株以及甘肃省1株；类群7共计有虫株102株，有广东省的1株，河南省的3株，广西壮族自治区的2株，湖北省虫株3株，河南省虫株11株，江西省虫株2株，辽宁省虫株15株，浙江省虫株1株，四川省虫株3株，陕西省虫株12株，江苏省虫株32株，安徽省虫株14株，福建省虫株3株；类群8共计有118株虫株，包含广东省的8各虫株，湖南省的5个虫株，广西壮族自治区的3个虫株，湖北省的13个虫株，河南省的2个虫株，江西省的8个虫株，辽宁省的1个虫株，云南省的1个虫株，浙江省的20个虫株，山东省7株，四川省8株，陕西省5株，江苏省16株，安徽省6株，福建省6株，重庆市5株，贵州省4株。 3、华中地区30个虫株中共获得8，333，375个SNPs位点，所有SNP位点统计分析显示，HB(湖北)15、HEN(河南)20、HN(湖南)07、HN08和HN10的SNP位点数量与纯合子数量均显著高于其他虫株。此外，在HB15、HEN20、HN07、HN08和HN10虫株中出现频率最高的突变基因型为A＞G、C＞T、G＞A、T＞C，而其他虫株则为A＞G、C＞G、C＞T、G＞A、G＞C、T＞C。聚类结果表明，华中地区30株松材线虫可以分为4个类群：HB15、HEN20、HN07、HN08和HN10为同一类群；HB02、HEN02、HEN04和HN06为类群2；类群3虫株最多，共有16个虫株；类群4全部为河南虫株(HEN06、HEN09、HEN10、HEN14和HEN15)。与广东省和江苏省虫株进行种群遗传差异分析发现，HB15、HEN20、HN07、HN08和HN10与广东省虫株具有亲缘关系，其他虫株与江苏省虫株的遗传距离相对较近，其中河南省虫株间遗传差异显著。华中地区虫株之间存在明显的遗传分化现象，推测华中地区大部分疫区和江苏省的松材线虫具有相同的疫源，少部分地区和广东省虫株具相同的疫源。 4、本研究通过对中国两广地区的松材线虫进行遗传多样性分析，发现两广地区的大部分虫株与中国另一个松材线虫病传播中心——江苏省的虫株的遗传距离很远，两广地区的虫株仅有一部分与江苏省的虫株聚为一类。两广地区的虫株的遗传多样性普遍比江苏省的虫株高，且广东省的松材线虫的遗传多样性最丰富。广东省具有自己的传播源，推测来自国外；而部分的广东和广西的虫株可能来自江苏。选择性清除结果表明，两广地区的类群B的虫株的候选基因富集在果胶裂解酶活性等相关基因上，猜测该类群具有更强的毒力，可能危害更多的松树。需要防治松材线虫通过人为途径传播到非疫区，以危害更多松树。本研究为探究两广地区的松材线虫的生存空间、遗传结构、潜在传播空间和制定相关防疫政策提供理论依据。5、在前人构建的松材线虫疫源追溯数据库(PWNSD)，具有数据存储、检索、浏览、系统发育树构建、序列比对以及引物设计等功能。提供的Web界面，将松材线虫基因组序列以及相关变异位点的基因和蛋白序列等信息进行可视化，提供更直观的数据展示。选取新发疫区甘肃省的虫株对系统功能的实现进行测试，结果与第三章遗传多样性分析结果一致，证实实现情况良好。目前库内包含了实验室组装的基因组数据以及701个松材线虫虫株的相关数据。