触发phasiRNAs的miRNAs参与湿地松胚性愈伤增殖过程的稳态维持

[目的]为探究非酚类物质积累导致的胚性愈伤团褐变机制，解析小分子RNA在其中发挥的调控作用。[方法]以遗传背景相同的抗/易褐变胚性无性系为研究对象，将二者的胚性愈伤团于继代后第0天，第7天和第14天取样，进行小RNA测序、转录组测序及降解组测序，然后基于多组学联合分析，解析小RNA及其靶基因级联网络及可能的生物学功能。[结果]抗/易褐变胚性愈伤团小RNA序列的长度特征有明显差异，长度为24nt的小RNA数量在易褐变胚性愈伤中0d最高，但抗褐变材料中14d最高，且占比为易褐变材料的2倍。从中共鉴定到291个miRNA，包括37个火炬松已知的miRNA、67个物种间高度保守的miRNA、92个非保守的miRNA以及95个全新的miRNA.其中，长度为21nt的miRNA有126个(45.16％)，长度为22nt的miRNA有77个(27.60％)。这些miRNA中仅有23个为高表达miRNA，包括保守的miR166、miR482、miR319、miR390等，也有裸子植物特有的miRNA以及新鉴定的miRNA;而另外149个miRNA为中等表达miRNA，104个为低表达miRNA.与易褐变的胚性愈伤相比，各时间节点上抗褐变材料中表达上调的miRNA较多;而随着培养时间的延长，抗褐变胚性愈伤中较多miRNA表达下调，而易褐变材料在0-7d时仍有较多miRNA上调。进一步预测差异miRNA的靶基因并进功能富集，防御反应(Defense response)和信号转导(Signal transduction)等生物学过程被显著富集。通过降解组分析被靶向切割的位点形成的峰值位置，验证所预测的靶基因是否真实被miRNA切割，发现仅有三成所预测的靶基被降解组验证。通过检查T-plot图并人工矫正，从中最终获得42个可靠的经降解组确认的靶基因，由33个miRNA靶向切割，其中还包括5个全新的miRNA.这些经验证的靶基因中有32个的注释为unknown，通过借助湿地松体胚过程的三代转录组数据，对这些基因的注释进行矫正，发现这些靶基因中，3个为miR166的靶基因，编码HD-ZIP转录因子，2个为miR160的靶基因，编码ARF转录因子，1个为miR397的靶基因，编码漆酶(Laccase)，其余均靶向各类抗性R基因(Resistance genes)。由于miRNA靶向这几类R基因通常会形成phasiRNA，进一步鉴定了phasiRNA的产生位点，发现了162个PHAS位点，其中有42个由miRNA触发，且有一条完整的级联反应链经小RNA组和降解组证实：miR3701靶向PHAS位点(Scaffold199784_147680：48113)触发phasiRNA产生，而其中一个phasiRNA(UCGUAACUCCA UCUUAAUCGU)继续靶向下一个靶基因，将其表达量控制在很低的水平。[结论]抗褐变与易褐变胚性愈伤中，差异miRNA的靶基因大多为抗性R基因，大量phasiRNA被miRNA触发并形成级联反应，将相应靶基因的表达精细控制在较低的水平，从而维持了高速增殖的胚性愈伤团的稳态，降低了褐变的发生。