竹笋多肽的发酵制备及其降血糖活性研究

[目的]二肽基肽酶-IV(DPP-IV)是一个重要的Ⅱ型糖尿病治疗靶点，寻找安全、高效的DPP-IV 酶天然抑制剂已成为近年来的研究热点。植物源生物活性肽具有抗氧化、降血糖、降血压、抑菌等多种生理活性，一般不具毒性、易被人体吸收，在慢性病防治领域具有广泛应用前景。竹笋中含有丰富的蛋白质，氨基酸种类齐全，是优质的生物活性肽的潜在来源。本研究旨在通过微生物发酵法制备竹笋源活性多肽，鉴定肽段结构，评价降血糖活性，并阐明其活性作用机制，为竹笋的高值化利用提供研究基础。[方法]本研究使用课题组前期分离纯化得到的一株高地芽胞杆菌(Bacillus altitudinis)ICBR-C01 对毛竹竹笋匀浆进行发酵;采用离心超滤法回收低分子量(<3 kDa)肽，进一步采用柱色谱分离纯化;通过质谱鉴定发酵液中肽的氨基酸序列信息。应用Peptide Ranker、BIOPEP-UWM等数据库和UniDL4BioPep等基于机器学习的生物信息学工具对竹笋多肽进行生物活性预测。对可能具有抑制DPP-IV活性的多肽进行固相合成;测定竹笋多肽的抑制DPP-IV活性;利用分子对接模拟揭示竹笋降血糖肽与靶标蛋白的互作方式。[结果]利用高地芽胞杆菌(Bacillus altitudinis)ICBR-C01 发酵竹笋匀浆，发酵时间 12 h、料液比 100 g/L、接菌量 8%，上清液经超滤后可回收低分子量肽得率为 0.169 mg/g RM.对比发酵前后鉴定得到的肽段序列，发酵后新生成了30条肽段，由7～18个氨基酸组成，分子量范围为 500～1700 Da.活性预测结果显示其中5 条肽可能具有DPP-IV抑制活性。体外酶抑制测定结果表明，GFAGDDAPR、GLAGPPGS的抑制DPP-I V活性的IC50值分别为 541.7933 μM、367.2438 μM.这两条肽段与DPP-IV蛋白(PDB ID:5J3J)分子对接结果显示其可以与DPP-IV蛋白形成稳定结合。GFAGDDAPR能够深入DPP-IV活性口袋内部，与Tyr75 2、Trp563、Gly741和Tyr48残基各形成一个氢键，与Arg560 残基形成两个氢键，且可以与蛋白关键催化活性区域S1亚基中氧阴离子孔的Tyr547残基形成π-π键;GLAGPPGS同样能够深入DPP-IV活性口袋内部，与Asn562、Val558、Pro510、Lys512 和Met509残基各形成一个氢键。从而形成紧密结合，发挥抑制作用。[结论]利用高地芽胞杆菌(Bacillus altitudinis)ICBR-C01发酵能够对竹笋蛋白进行高效转化，制备系列具有DPP-IV抑制活性的多肽。本研究为竹笋精深加工制备竹笋降血糖功能肽，进而在功能性食品及药物领域实现高值化应用提供理论依据;同时为新型DPP-IV抑制肽的研究提供参考。