核桃JrGA20ox1基因表达砧木对野生型接穗的性状调控

[目的]本研究建立了基于核桃赤霉素氧化酶基因 JrGA20ox1表达砧木的微型嫁接体系，旨在阐明干旱胁迫下核桃砧木和接穗之间JrGA20ox1衍生信号通信的机制，为果树砧穗信号调控机理研究提供技术平台和理论依据。[方法]本研究建立了基于核桃赤霉素氧化酶基因JrGA 20ox1 表达砧木的微型嫁接体系，分别以核桃JrGA20ox1-OE、JrGA20ox1-RNAi和野生型植株为砧木，核桃野生型植株为接穗进行嫁接，待嫁接单元愈合完全后对接穗进行株高、节间长、气孔形态等表型观察、生理指标测定、转录组测序、sRNA 测序等，筛选差异基因，并利用荧光定量PCR 和双荧光素酶报告系统实验对差异基因进行进一步验证。[结果](1)核桃砧木 JrGA20ox1表达量负调控野生型接穗的抗旱性。对 WT/WT、WT/OE、WT/RNAi 微型嫁接植株干旱胁迫 2 W后，WT/RNAi嫁接组合接穗的生长状况良好，叶片翠绿，而WT/OE和WT/WT嫁接组合接穗的叶片呈现黄化脱落。WT/RNAi嫁接组合接穗的自然失水率和气孔开度显著低于WT/WT，WT/OE嫁接组合接穗的自然失水率和气孔开度显著高于WT/WT;进一步研究发现WT/RNAi嫁接组合接穗的内源ABA含量显著高于WT/WT，WT/OE嫁接组合接穗的内源ABA含量显著低于WT/WT。(2)砧木JrGA20ox1 基因DNA、mRNA及其蛋白质未向野生型接穗移动，活性GAs可向野生型接穗移动。对干旱胁迫下WT/WT和WT/OE嫁接组合的野生型接穗进行PCR、qRT-PCR和GFP荧光信号观察，发现 JrGA20ox1-GFP的DNA和GFP荧光仅存在JrGA20ox1-OE砧木中，WT/OE与WT/WT接穗JrGA20ox1 表达量无显著差异，表明砧木JrGA20ox1 基因DNA、mRNA及其蛋白质未向野生型接穗移动。分别测定各嫁接组合砧穗活性GAs含量发现，WT/OE接穗中GA4 含量显著高于WT/WT，WT/RNAi接穗中GA1、GA4 和GA7的含量显著低于WT/WT接穗;表明GA4 或其前体GA12从JrGA20ox1过表达砧木移动到野生型接穗。表明砧木JrGA20ox1 基因DNA、mRNA及其蛋白质未向野生型接穗移动，活性GAs向野生型接穗移动，进而影响接穗的生长和抗旱性。(3)JrGA20ox1-RNAi砧木中产生的sRNAs传递到野生型接穗。对干旱胁迫下WT/WT和WT/RNAi嫁接组合的野生型接穗进行qRT-PCR，发现与WT/WT相比，WT/RNAi接穗JrGA20ox1 表达量降低;而sRNAs测序发现在WT/RNAi接穗中约比对到 2069 条目标sRNAs，其中最多的是 21-nt sRNAs，其次是 24-nt sRNAs，而在WT/WT接穗中，几乎比对不到目标sR NAs.表明JrGA20ox1-RNAi砧木中产生的sRNAs转移到野生型接穗，影响了接穗JrGA20ox1的表达，进而使野生型接穗中活性GAs含量下降，从而影响野生型接穗的抗旱性。(4)砧木JrGA 20ox1 基因表达调控野生型接穗干旱胁迫响应转录因子LOL1 和FAR1，进而调控LUBP和Stig1等多个干旱胁迫响应基因，从而调控野生型接穗抗旱性。利用转录组测序技术对WT/WT、WT/OE、WT/RNAi在干旱胁迫条件下的野生型接穗进行测序，获得 49 个干旱胁迫响应基因，其中包含两个转录因子LOL1 和FAR1，且49个响应干旱胁迫基因中 37个基因响应外源GAs处理。双荧光素酶报告系统实验和酵母单杂交验证干旱相应基因的上游调控机制发现，干旱胁迫响应转录因子LOL1 和FAR1 与分别调控12 个和11 个干旱胁迫响应基因启动子，并存在多个结合位点。表明砧木JrGA20ox1 表达影响转录因子FAR1 和LOL1 与LUBP和Stig1 等启动子的多个位点相结合，进而响应干旱胁迫。[结论]本研究基于核桃 JrGA20ox1 基因表达砧木的微型嫁接体系，验证了JrGA20ox1 基因DNA、mRNA及其蛋白质不由砧木向野生型接穗移动，sRNAs和活性GAs等可由砧木向野生型接穗移动，调控野生型接穗的生长及抗旱性。为阐明木本植物砧穗间信号传递及调控机制提供了研究模型，具有重要的理论和实践价值。