纤维素酶CEL调控香榧幼果落果的分子机理解析

[目的]香榧在每年 4 月底至 5 月中旬常常出现严重的幼果脱落现象，脱落率高达 80-90%，对经济造成极大的损失，限制了香榧产业的发展。纤维素酶在植物器官脱落中起重要作用，然而，有关香榧纤维素酶在落果中功能还知之甚少。[方法]本研究基于香榧落果关键期落果与正常果离区的转录组分析，通过系统进化关系分析克隆并鉴定了与香榧落果相关的TgCEL基因，利用实时荧光定量 PCR 技术，分析该基因在不同源库处理中离区中的表达，运用转基因拟南芥体系、本体瞬时过表达等技术分析其生物学功能;并采用WGCNA分析筛选出可能调控TgCEL的关键候选转录因子，并利用双荧光素酶试验、酵母单杂交、瞬时过表达与抑制及蛋白互作试验、酵母双杂、等试验分析不同转录因子对关键基因的作用效应与调控机制。[结果]1)通过对不同源库处理的落果率及 TgCEL 的表达量分析，发现环剥剪叶和乙烯利浸泡处理下香榧落果率显著升高，且其离区的TgCEL基因均显著上调;进化树分析表明TgCEL与日本柳杉的纤维素酶聚到一起，亚细胞定位分析表明TgCEL定位于细胞膜;对香榧种实分别进行瞬时过表达TgCEL基因和瞬时抑制TgCEL基因，其落果率也呈显著增加和降低趋势，同时TgCEL转基因拟南芥，发现其花器官较野生型明显提早脱落。2)利用WGCNA筛选出与TgCEL协同表达的30个转录固子，双荧光素酶试验和烟草活体成像表明TgERF114.5、TgNAC25、TgNAMB2、TgWRKY11、TgWR KY62、TgNAC56.1、TgMYB44 对TgCEL启动子均有激活效应，酵母单杂交试验表明TgWRKY 11和TgNAC56.1 直接结合TgCEL启动子;且在香榧种实中分别瞬时过表达和瞬时抑制这瞬时抑制TgWRKY62，其TgCEL的表达量显著上调和下调，落果率也呈相同的变化趋势。3)酵母单杂交试验分析表明TgERF114.5 不直接结合TgCEL的启动子，TgWRKY62 直接结合TgGPPS的启动子;烟草双荧光素酶混合调控效应分析表明TgWRKY62 和TgERF114.5 可协同激活TgCEL的启动子活性;蛋白互作试验LCI和酵母双杂表明，TgWRKY62 与TgERF114.5存在蛋白间互作作用。[结论]明确了TgCEL在香榧落果中发挥的关键作用，解析了TgWRKY62与TgERF114.5协同激活TgCEL的转录调控机制。研究结果可为探寻减轻香榧落果、提高产量的调控措施，为促进香榧的高产稳产、可持续发展提供理论依据。