苯丙烷代谢关键基因Cc4CL3对山核桃愈伤组织褐化的影响

木质素、类黄酮等酚类化合物参与了植物的生物或非生物胁迫响应，同时作为氧化反应的底物影响着组织培养材料的褐化。4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)是苯丙烷代谢途径关键限速酶，调控着下游代谢流向，不同4CL同源基因可能参与不同酚类物质的合成而影响褐化。山核桃是重要经济林树种，褐化问题突出。本研究以山核桃为代表研究 4CL 基因与褐化的关系，首先通过表型观察结合二乙酸荧光素(FDA)染色跟踪山核桃愈伤组织的褐化进程，探究愈伤组织褐化的规律，继代后 7-10天荧光最强，愈伤增殖最快，继代17天时荧光强度局部减弱，随后愈伤组织快速褐化，继代24天时愈伤组织褐化严重，无法增殖;利用TBtools等生信工具筛选山核桃 4CL家族成员，共鉴定出4 个 4CL成员，通过系统发育进化树的构建发现Cc4CL1、Cc4CL2、Cc4CL4 聚类在I型分支，可能参与木质素合成，Cc4CL3 聚类在Ⅱ型分支，可能与其他苯丙烷类合成相关;通过RT-qPCR分析各成员表达特征，不同分支的 4CL在愈伤组织褐化发生前后表达量变化差异明显，其中Cc4CL3 在17天后愈伤组织出现褐化时显著上调表达，可能是影响褐化的关键4CL基因;克隆Cc4CL3 基因序列，构建 35S∷Cc4CL3-GFP过表达载体，获得的Cc4CL3过表达愈伤组织系与对照相比增殖困难，褐化进程提前;之后在Cc4CL3 基因第一个外显子上设计一条特异性的gRNA，采用CRISPR/Cas9 技术对Cc4CL3 基因进行编辑，和对照相比，基因编辑Cc4CL3 愈伤组织系增殖显著加快，褐化被抑制;通过外施NAA可以改善过表达Cc4CL3 愈伤组织生长不良的现象，缓解褐化程度，而对基因编辑Cc4CL3 愈伤组织促进增殖效果不明显，且愈伤组织呈现淡黄色。综上所述，FDA染色可作为指示剂用于表征愈伤组织褐化的发生，Cc4CL3 的表达影响着愈伤组织褐化的发生，NAA可以缓解过表达Cc4CL3愈伤组织的褐化程度。