枣疯病植原体致病因子Zaofeng3的原核表达

枣疯病是枣栽培过程中一种致死性病害，枣树一旦感染枣疯病，小树2-3 年，大树4-5 年就会整株死亡，给我国枣产业带来巨大的经济损失。实验室前期以枣疯病植原体基因组信息为研宄基础，共获得 694 个编码蛋白的基因。根据植原体效应因子的特性从中共筛选得到8 个含有N端信号肽、不含有跨膜区域且定位于潜在移动元件(PMU)区域的枣疯病植原体效应因子。根据其在枣疯病植原体基因组中的基因定位顺序，依次命名为Zaofeng1-Zaofeng8.其中Zaofeng3 属于SAP54 类效应因子。为了研究枣疯病植原体致病因子Zaofeng3 基因的功能，利用生物信息学和PCR方法对该基因序列进行分析，并从感染枣疯病(Jujube witches'broom，JWB)的病枣叶片总DNA中克隆基因Zaofeng3 CDS区，测序结果显示该基因大小为 366 bp，和GenBank里的CDS序列相符(GenBank登录号AYJ01078.1)，利用ProtParam软件在线分析Zaofeng3 蛋白序列，结果显示其氨基酸的分子量大小为 14.24943 Kda，等电点为 7.89，属于弱碱性氨基酸。蛋白序列的平均亲水性数值为-0.630，属于亲水性蛋白。不稳定指数大小为 44.62，归为不稳定蛋白。蛋白质的跨膜区通过TMHMM在线软件预测，结果发现Zaofeng3 蛋白序列具有明显的跨膜区域，跨膜区域的位置在第 10至27个氨基酸之间，同时去除信号肽后不含有额外的跨膜区。综上，Zaofeng3符合分泌蛋白的结构，与signalP分析结果一致，可以分泌到胞外发挥其功能。利用PSIPRED在线软件分析Zaofeng3 蛋白二级结构，结果显示Zaofeng3 蛋白主要由a螺旋组成，没有发现β折叠。以表达载体pET-15b为骨架，构建了Zaofeng3基因的原核表达载体pET-15b-Zaofeng3，转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，挑单克隆阳性单菌落摇菌，在菌液OD值达到0.6-0.8左右，诱导Zaofeng3蛋白表达，设置不同IPTG浓度(0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L)、不同诱导时间(0 h、2 h、4 h、6 h、8 h)，并采用SDS-PAGE电泳方法进行检测，分析诱导该蛋白表达的较好条件。结果显示:Zaofeng3 基因编码 122 个氨基酸，融合蛋白分子质量为 15.08 kDa，与预测蛋白大小相符，该蛋白在大肠杆菌中最佳诱导条件是在菌液中加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG，在37℃诱导 4 h.研究结果为Zaofeng3 蛋白的功能分析奠定了理论及材料基础。