基于瞬时遗传转化揭示黑果枸杞LrSAUR启动子的特性

[目的]通过不同长度LrSAUR启动子克隆及瞬时遗传转化方法揭示黑果枸杞LrSAUR启动子特性。[方法]以长势良好的黑果枸杞(Lycium ruthenicum)无菌组培苗为试验材料，通过摸索农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮(AS)浓度、瞬时侵染时间和共培养时间建立瞬时转化体系。采用 PCR 方法克隆获得LrSAUR启动子，构建LrSAUR启动子连接GUS基因的载体，瞬时转化黑果枸杞，分析不同组织中GUS基因表达水平，进而采用外源喷施生长素吲哚-3-乙酸(IAA)和水杨酸(SA)的方法探究启动子对两种激素的响应能力以及驱动GUS基因表达能力的变化，采用GUS染色及酶活测定评估启动子控制GUS基因的表达水平。[结果]1)当农杆菌菌液浓度OD600=0.6，在其中添加 150 μmol/L AS，侵染时间 4 h，农杆菌与幼苗共培养2 d时，瞬时转化黑果枸杞效果最佳。2)克隆获得黑果枸杞LrSAUR启动子(2988 bp)，构建了全长和截断突变启动子的载体 p101GUS:proE(-2988)、p101GUS:proD(-2686)、p101GUS:proC(-1 826)、p101GUS:proB(-788)、p101GUS:proA(-415)共 5 个;3)通过农杆菌介导法对黑果枸杞和烟草(Ni cotiana benthamiana)进行瞬时遗传转化，GUS染色及酶活测定显示-2988 bp的LrSAUR启动子驱动GUS基因表达水平最高。4)LrSAUR启动子控制GUS基因在黑果枸杞叶片和少部分根和茎表达，是组织特异性启动子。5)基于瞬时遗传转化材料IAA和SA处理结果显示，在-788～-1826 bp之间存在着生长素响应元件，-2686～-2988 bp 之间可能存在着未知的生长素负调控元件;在-415～-1826 bp 之间存在着未被发现的SA响应元件。[结论]成功建立了农杆菌介导的黑果枸杞瞬时遗传转化体系，克隆黑果枸杞LrSAUR基因启动子并构建了启动子全长及截断长度的载体，发现LrSAUR启动子是组织特异性的且全长启动子驱动GUS基因表达水平最高，LrSAUR启动子有生长素响应元件(-788～-1826 bp)、生长素负调控元件(-2686～-2988 bp)、SA响应元件(-415～-1826 bp)。本研究为揭示LrSAUR基因的功能机制奠定了基础。