调控毛竹细胞壁形成关键circRNAs鉴定及功能分析

毛竹(Phyllostachys edulis)是我国种植面积最大的竹种，其生长速度快、产量高、可再生能力强，是优良的木材替代品。竹材的性能与细胞壁组成成分密切相关，研究表明在毛竹生长过程中，构成细胞壁成分的木质素、纤维素、多糖等含量也会发生相应变化，导致竹材性能的改变。环状 RNA(circRNAs)是具有共价封闭结构的内源性非编码 RNA，在植物中具有重要的功能。然而，它们对于毛竹细胞壁形成的作用未知。因此分析毛竹细胞壁生物合成相关 circRNAs 对竹材的性能改良具有重要意义。本研究对四个生长时期——10 天、20 天、30 天、40 天的毛竹样品分别进行高通量转录组测序，筛选出与细胞壁生物合成相关的两个关键circRNAs，构建过表达载体，转化水稻并得到转基因水稻植株。结合生物信息分析和分子生物实验，探究circRNAs在毛竹生长过程中对于细胞壁生物合成发挥的功能。鉴定得到 2973个circRNAs，其中差异表达的circRNAs共237 个，结合ORF序列以及IRES区域分析circRNAs编码蛋白能力。基于基因本体论(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)对差异表达的circRNA亲本基因进行功能预测，同时构建了circRNA-miRNA-mRNA互作网络。最终筛选出2个与细胞壁形成相关的circRNAs，分别为:novel_circ_001532和novel_circ_002484，它们的亲本基因分别是PH02Gene34473 和PH02Gene44766.CircRNA验证实验结果证实了大多数circrna确实抵抗外切酶降解，Sanger测序进一步说明novel_circ_001532 和novel_circ_002484 是真实的circRNA.RT-qPCR分析结果表明:novel-circ-001532 的表达量在 10 天时最高，且 3 个实验组(20天，30天，40天)相比于 10天均呈现显著差异;novel-circ-002484的表达量在3个实验组基本一致，相比于 10 天均呈现显著差异;对目标 circRNA的亲本基因进行亚细胞定位发现:PH02Gene34473 和PH02Gene44766 均位于细胞核区域。毛竹在4个时期的细胞壁超微结构呈现不同层面的变化:从初生壁沉积到次生壁开始形成、加厚至多层次生壁形成;细胞角隅自溶现象随生长而加剧，溶解的角隅形成颗粒状物质。间苯三酚染色法掲示随着毛竹幼苗的生长，木质化程度越高，且同一时期茎部木质化程度较高于叶片部位，这种差距随着生长时期不断加大。此外，毛竹细胞壁不同种类细胞的木质化程度规律为:纤维细胞最早开启木质素沉积且完全木质化周期最短。薄壁细胞木质化的启动晚于纤维细胞。测定 4 个生长时期的毛竹不同组织——茎、叶木质素含量，结果显示两者木质素含量变化趋势一致。本研究为理解circRNA对毛竹细胞壁生物合成过程中发挥的作用提供了初步的见解，并为竹子的良种繁育研究提供了新的见解。